에피 솜 벡터를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터의 통합없이 유도 다 능성 줄기 세포의 생성
Summary
This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.
Abstract
유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)는 질병 모델링 및 재생 치료를위한 위대한 약속을 개최합니다. 우리는 이전에 말초 혈액 단핵 세포 (PB 다국적)에서 통합없는 iPSCs를 생성하는 에피 솜 벡터 (EV)의 사용을보고 하였다. 사용되는 에피 솜 벡터들은 각각 포유 동물 세포에서 플라스미드의 복제 및 장기 retainment 허용 엡스타인 – 바르 (EB) 바이러스로부터 oriP 및 EBNA1 요소 혼입 DNA 플라스미드이다. 상기 최적화, IPSC 콜로니 수천 말초 혈액 1 ㎖로부터 얻을 수있다. 높은 프로그래밍 효율성을 달성하기위한 두 가지 중요한 요인은 : 1) (2A)의 사용은 "자가 절단은"펩티드 따라서 두 요인 등몰 발현을 달성 OCT4 및 SOX2을 연결하는 단계; 2) 두 벡터의 사용은 MYC 및 KLF4에게 개별적으로 표현합니다. 여기 통합없는 IP를 생성하는 단계별 프로토콜을 설명성인 말초 혈액 샘플에서 희주. 잔류 에피 솜 플라스미드 다섯 구절 후 발견 할 수없는만큼 생성 된 iPSCs 통합-무료입니다. 리 프로그래밍 효율이 센다이 바이러스 (SV) 벡터에 필적하지만, EV 플라스미드 상당히 경제적 시판 SV 벡터 이상이다. 이 저렴한 EV의 재 프로그래밍 시스템은 재생 의학의 임상 적용 가능성 보유 등 통합이없는 중간 엽 줄기 세포, 신경 줄기 세포에 PB의 다국적 기업의 직접 리 프로그래밍에 대한 접근 방식을 제공합니다.
Introduction
여러 전사 인자의 발현 후 강제 (즉, OCT4, SOX2, MYC 및 KLF4)는, 체세포는 재생 의학 및 세포 대체 요법 1-3에서 응용 프로그램에 대한 큰 약속을 보유 유도 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)로 재 프로그램 할 수있다. 지금까지 다양한 방법이 4-7 재 프로그래밍의 성공율을 높이기 위해 개발되었다. 바이러스 통합 재 프로그래밍 요소에 대한 높은 수준의 안정적인 발현을 유도하기 때문에 바이러스 벡터 – 유도 리 프로그래밍 널리 iPSCs의 효율적인 생성을 위해 사용된다. 그러나, 세포 게놈 내로 벡터 DNA 영구 통합 삽입 성 돌연변이 5를 유도 할 수있다. 또한, 프로그래밍 요소의 부족 불 활성화는 iPSCs 차별화 8을 방해 할 수있다. 이와 같이, 프로그래밍 요소의 통합없이 iPSCs의 사용은 특히 세포 치료 응용에 사용하기 위해 필수적이다.
<p class="jove_content"> 에피 솜 벡터 (전기 자동차)을 광범위하게 통합 무료 iPSCs의 생성에 사용됩니다. 가장 일반적으로 사용되는 EV는 엡스타인 바 바이러스 (EB) 바이러스 (9)로부터 두 개의 요소, 바이러스 복제 (oriP) 및 EB 핵 항원 1 (EBNA1)의 기원을 함유하는 플라스미드이다. EBNA1 요소가 숙주 세포의 분열 동안 에피 솜의 분할 가능 염색체 DNA에 함유 oriP 플라스미드 DNA를 테더 동안 oriP 요소는 포유 동물 세포에서 플라스미드의 복제를 촉진한다. 센다이 바이러스 (SV) 및 RNA 형질 감염을 포함하는 다른 통합 프리 방식에 비교하여, 전기 자동차에는 여러 장점 5,6,10-을 갖는다. 이들을 매우 저렴하게 플라스미드 DNA로서, 전기차가 용이하게 제조 될 수 있고 변형 된 집. 또한, EV으로 재 프로그래밍하는 여러 RNA 형질 감염을 성공적 프로그래밍에 필요한 반면 전기차 단일 형질, IPSC 생성 충분하므로 덜 노동 집약적 인 공정이다.디ermal 섬유 아세포는 많은 프로그래밍 연구에서 사용되어왔다. 그러나, 피부 생검 침입 통증 프로세스뿐만 아니라, 프로그래밍을위한 충분한 양의 세포를 확대 배양 시간 소모적 일뿐만 아니라. 큰 우려 성인 공여자의 피부 세포는 종종 따라서 피부 섬유 아세포 (11, 12)로부터 유도 iPSCs 대한 응용을 제한 종양과 관련된 돌연변이를 초래할 수있다 장기간 UV 광 방사선에 노출되어있다. 최근에는 정상적인 인간의 피부 세포가 체세포 돌연변이 및 피부 편평 세포 암종의 주요 드라이버의 대부분을 포함한 여러 암 유전자를 축적하는 것이보고되어있다, 강한 긍정적 인 선택 (13)을 받고있다.
1) 혈액 세포 쉽게 최소 침습 과정을 통해 얻어 질 수 있기 때문에, 피부 섬유 아세포는 대조적으로, 말초 혈액 (PB) 세포 리 프로그래밍에 대한 세포의 바람직한 원천 2) 말초 혈액 세포는 조혈 줄기 세포의 자손이다골수에 존재하는, 따라서 유해한 방사선으로부터 보호. 말초 혈액 단핵 세포 (PB 다국적)는 피콜-Hypaque (1.077 g / ㎖)를 사용하여 간단한 구배 원심 다음 버피 코트 층에서 시간에 수집 될 수있다. 얻어진 PB의 다국적 기업은 림프구, 단핵구 몇 조혈 전구 세포 (HPC의) (14)로 구성된다. 인간 T 림프구가 PB의 주요 세포 종류 중 하나는 성숙이지만 T 세포는 T 세포 수용체 (TCR) 유전자의 재 배열을 포함하며, 따라서 어플리케이션 (15, 16)에 대한 잠재적 인 제한 온전한 게놈 부족하다. 그러나, IPSC 생성을 통해 T 세포의 회춘은 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 치료 17-19에서 응용 가능성을 가질 수있다. 비교에서의 HPC는 그대로 게놈을 용이하게 재 프로그래밍한다. 비록 단지 0.01 – 말초 순환에 0.1 %의 HPC 세포는 이들 세포가 확대 될 수있는 생체 적혈구 매체 erythr 증식 호의 해당OID 전구 세포 (14).
이전 연구에서는 PB의 재 프로그래밍의 효율성 고체 (20)의 10 배 증가 귀착 야마나카 인자 (OCT4, SOX2, MYC 및 KLF4)에 더하여 요인 BCL-XL을 사용했다. 또한 BCL2L1라고도 BCL-XL은 카스파 제 (21, 22)의 활성화를 억제함으로써 세포 사멸의 강력한 억제제이다. 그러나, BCL-XL은 능성 (21, 22)을 유지하는 데 중요한 역할을 할 수있다. 최근에, 우리는 또한 개별적으로 프로그래밍 효율 (23)의 약 100 배 증가로 연결 두 벡터와 MYC 및 KLF4를 표현함으로써 우리의 EV의 재 프로그래밍 시스템을 최적화했다. 건강한 공여자로부터 0.5 % -이 방법을 사용하여, 형질 감염에서 세포 수를 시작으로 나눈 콜로니 번호에 의해 정의 된 리 프로그래밍 효율은 0.2이다. 다음으로, 우리는 PB에서 통합 무료 iPSCs를 생성에 대한 자세한 실험 절차를 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
건강한 기증자 또는 환자의 혈액 샘플을 취득하면 기초 연구 및 임상 세포 치료를위한 매력적인 셀 소스 만들기, 편리하고 비 침습적이다. 여기에서 우리는 말초 혈액 샘플에서 통합 무료 iPSCs의 효율적인 생성을위한 프로토콜을 설명했다. 이 재현하고 저렴한 방법은 IPSC 필드를 수혜가 예상된다.
우리는 고도로 효율적인 PB의 리 프로그래밍 (30)에 대한 책임이 중요한…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Ministry of Science and Technology of China (2015CB964902, 2013CB966902 and 2012CB966601), the National Natural Science Foundation of China (81500148, 81570164 and 81421002), the Loma Linda University School of Medicine GCAT grant (2015), and Telemedicine and Advanced Technology Research Center (W81XWH-08-1-0697).
Materials
| Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | Sigma | S0192 | Store at 4 °C |
| Human stem cell factor (SCF) | Peprotech | 300-07 | Store at -20 or -80°C |
| Interleukin-3 (IL-3) | Peprotech | AF-200-03 | Store at -20 or -80°C |
| Eryrthropoietin (EPO) | Peprotech | 100-64 | Store at -20 or -80°C |
| Insulin growth factor-1 (IGF-1) | Peprotech | 100-11 | Store at -20 or -80°C |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Store at -20 or -80°C |
| 1-thioglycerol (MTG) | Sigma | M6145 | Store at -20 or -80°C |
| DMEM/F12 medium | Gibco | 112660-012 | Store at 4 °C |
| L-glutamine (100x) | Gibco | 25030-081 | Store at -20 °C |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Gibco | 15140-122 | Store at -20 °C |
| Non-essential amino acids solution (100x) | Gibco | 11140-050 | Store at 4 °C |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | Peprotech | 100-18B | Store at -20 or -80°C |
| ITS (100x) | Gibco | 41400-045 | Store at 4 °C |
| Ascorbic acid | Sigma | 49752 | Store at -20 °C |
| DMEM (high glucose) medium | Thermo | SH30243.01B | Store at 4 °C |
| FBS | Hyclone | SV30087.01 | Store at -40 °C |
| Ficoll | GE Healthcare, SIGMA | 17-5442-02 | Store at RT |
| Trehalose | Sigma | T9531 | Store at 4 °C |
| DMSO | Sigma | D2650 | Store at RT, protect from light |
| Endofree Plasmid Maxi Kit(10) | Qiagen | 12362 | Store at RT |
| IMDM | Gibco | 21056-023 | Store at 4 °C |
| Human CD34+ Cell Nucleofection Kit | Lonza | VPA-1003 | Store at RT, nucleofection buffer and supplement buffer should be stored at 4 °C |
| Sodium butyrate | Sigma | B5887 | Store at -20 or -80°C |
| ROCK inhibitor Y27632 | STEMGENT | 04-0012-10 | Store at -20 °C |
| Essential 8 basal medium (E8) | Gibco | A15169-01 | Store at 4 °C, the supplement should be stored at -20 or -80°C |
| Matrigel | BD | 354277 | Store at -20 or -80°C |
| 2x EasyTaq PCR SuperMix(+dye) | TransGen Biotech | AS111 | Store at -20 °C |
| Cell detachment solution | STEMGENT | 01-0006 | Store at -20 °C, Accutase as a cell detachment solution to obtain a single cell suspension |
| DAPI | Sigma | D9542-1MG | Store at 4 °C or -20 °C |
| Anti-nanog-AF488 | BD | 560791 | Store at 4 °C, primary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/100 when use |
| Anti-OCT4 | abcam | ab19857 | Store at 4 °C, primary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/100 when use |
| AF488 donkey anti-mouse IgG | Invitrogen | A21202 | Store at 4 °C, secondary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/500 when use |
| PE anti-human TRA-1-60-R Antibody | Biolegend | 330610 | Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry |
| eFluor 570-conjugated anti-SSEA4 | eBioscience | 41-8843 | Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry |
| Isotype antibody | eBioscience | 11-4011 | Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry |
| Alkaline Phosphatase Detection Kit | SiDanSai | 1102-100 | Store at 4 °C |
| Genomic DNA Extraction Kit | TIANGEN | DP304-02 | Store at RT |
| Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | Store at RT |
| Flow cytometry cell analyzer | BD | LSRII | for flow cytometry analysis |
| Spinning disk confocal microscope (SDC) | PerkinElmer | UltraVIEW VOX | for confocal imaging |
| Nucleofection device | Lonza | Nucleofector 2b | for the nucleofection of PB MNC |
| ImageQuant LAS-4010 | GE | take photo of AP staining in bulk |
Referências
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell Stem Cell. 17, 11-22 (2015).
- Hayes, M., Zavazava, N. Strategies to generate induced pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 1029, 77-92 (2013).
- Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11, 264-274 (2013).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotechnol. 33, 58-63 (2015).
- Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31, 458-466 (2013).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9, 588-598 (2011).
- Dorigo, O., et al. Development of a novel helper-dependent adenovirus-Epstein-Barr virus hybrid system for the stable transformation of mammalian cells. J Virol. 78, 6556-6566 (2004).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat Protoc. 7, 2013-2021 (2012).
- Harms, P. W., et al. Next generation sequencing of Cytokeratin 20-negative Merkel cell carcinoma reveals ultraviolet-signature mutations and recurrent TP53 and RB1 inactivation. Mod Pathol. 29, 240-248 (2016).
- Abyzov, A., et al. Somatic copy number mosaicism in human skin revealed by induced pluripotent stem cells. Nature. 492, 438-442 (2012).
- Martincorena, I., et al. Tumor evolution. High burden and pervasive positive selection of somatic mutations in normal human skin. Science. 348, 880-886 (2015).
- Su, R. J., Neises, A., Zhang, X. B. Generation of iPS Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors. Methods Mol Biol. 1357, 57-69 (2016).
- Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Kishino, Y., Seki, T., Yuasa, S., Fujita, J., Fukuda, K. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions. J Vis Exp. , (2015).
- Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nat Protoc. 7, 718-728 (2012).
- Gill, S., June, C. H. Going viral: chimeric antigen receptor T-cell therapy for hematological malignancies. Immunological reviews. 263, 68-89 (2015).
- Su, R. J., et al. Efficient generation of integration-free ips cells from human adult peripheral blood using BCL-XL together with Yamanaka factors. PLoS One. 8, e64496 (2013).
- Li, Y., et al. The p53-PUMA axis suppresses iPSC generation. Nat Commun. 4, 2174 (2013).
- Hardwick, J. M., Youle, R. J. SnapShot: BCL-2 proteins. Cell. 138, 404 (2009).
- Wen, W., et al. Enhanced Generation of Integration-free iPSCs from Human Adult Peripheral Blood Mononuclear Cells with an Optimal Combination of Episomal Vectors. Stem Cell Reports. 6, 873-884 (2016).
- Zhang, X. B., et al. Trehalose ameliorates the cryopreservation of cord blood in a preclinical system and increases the recovery of CFUs, long-term culture-initiating cells, and nonobese diabetic-SCID repopulating cells. Transfusion. 43, 265-272 (2003).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. , (2010).
- Castiel, A., et al. Cell death associated with abnormal mitosis observed by confocal imaging in live cancer cells. J Vis Exp. , e50568 (2013).
- Peterson, S. E., et al. Teratoma generation in the testis capsule. J Vis Exp. , e3177 (2011).
- Ritner, C., Bernstein, H. S. Fate mapping of human embryonic stem cells by teratoma formation. J Vis Exp. , (2010).
- Wen, W., et al. Enhanced Generation of Integration-free iPSCs from Human Adult Peripheral Blood Mononuclear Cells with an Optimal Combination of Episomal Vectors. Stem Cell Reports. , (2016).
- Lo, C. A., et al. Quantification of Protein Levels in Single Living Cells. Cell Rep. 13, 2634-2644 (2015).
- Liu, S. P., et al. An improved method for generating integration-free human induced pluripotent stem cells. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 22, 580-587 (2014).
- Luni, C., et al. High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics. Nat Methods. 13, 446-452 (2016).
- Chou, B. K., et al. A facile method to establish human induced pluripotent stem cells from adult blood cells under feeder-free and xeno-free culture conditions: a clinically compliant approach. Stem Cells Transl Med. 4, 320-332 (2015).
- Nakagawa, M., et al. A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 4, 3594 (2014).
- Howden, S. E., et al. Simultaneous Reprogramming and Gene Correction of Patient Fibroblasts. Stem Cell Reports. 5, 1109-1118 (2015).
- Meng, X., et al. Rapid and efficient reprogramming of human fetal and adult blood CD34+ cells into mesenchymal stem cells with a single factor. Cell research. 23, 658-672 (2013).
- Liao, W., et al. Direct Conversion of Cord Blood CD34+ Cells Into Neural Stem Cells by OCT4. Stem cells translational medicine. 4, 755-763 (2015).
