エピソームベクトルを用いたヒト末梢血単核細胞からの統合フリー人工多能性幹細胞の生成
Summary
This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.
Abstract
人工多能性幹細胞（性IPSC）は、病気のモデリングと再生治療のための偉大な約束を保持します。我々は以前に、末梢血単核細胞（PBのMNC）から統合フリー性IPSCを生成するエピソームベクター（EV）の使用を報告しました。使用するエピソームベクターは、それぞれ 、哺乳動物細胞におけるプラスミドの複製および長期保持を可能にエプスタイン-バー（EB）ウイルスからのoriPおよびEBNA1の要素、が組み込まれたDNAプラスミドです。さらなる最適化では、IPSCコロニーの数千人は、末梢血の1ミリリットルから得ることができます。高再プログラミング効率を達成するための2つの重要な要因は次のとおりです：1）2Aの使用は「自己切断」は、ペプチドは、このように二つの要因の等モル発現を達成し、OCT4およびSOX2をリンクします。 2）個別MYCおよびKLF4を発現させるための2つのベクトルの使用を。ここでは、統合のないIPアドレスを生成するためのステップバイステップのプロトコルを記述します成人の末梢血サンプルからのSC。残留エピソームプラスミドは5継代後に検出されないようにして生成性IPSCは、統合フリーです。再プログラミング効率は、センダイウイルス（SV）ベクターに匹敵するが、EVのプラスミドは、かなりより経済市販SVベクターよりいます。この手頃な価格のEVの再プログラミング・システムは、再生医療における臨床応用の可能性を保持し、統合のない間葉系幹細胞、神経幹細胞などにPBの多国籍企業の直接再プログラミングするためのアプローチを提供します。
Introduction
いくつかの転写因子の強制発現した後、 （ すなわち OCT4、SOX2、MYCおよびKLF4）、体細胞は再生医療や細胞置換療法1-3のアプリケーションのための偉大な約束を保持して誘導された多能性幹細胞（性IPSC）に再プログラムすることができます。これまでに、さまざまな方法は、再プログラミング4-7の成功率を高めるために開発されてきました。ウイルスの統合が再プログラミング因子の高レベルの安定な発現を導くためのウイルスベクターによって誘発される再プログラミングが広く、iPS細胞の効率的な生成のために使用されます。しかし、細胞のゲノム中へのベクターDNAの永久的な統合は、挿入突然変異5を誘導し得ます。また、初期化因子の不十分な不活性化は、iPS細胞の分化8を妨害することができます。このように、初期化因子の統合なし性IPSCの使用は、特に、細胞療法用途における使用のために、必須です。
<p class="jove_content">エピソームベクター（電気自動車）が広く統合フリーiPS細胞の生成に使用されます。最も一般的に使用されるEVは、エプスタイン・バー（EB）ウイルス9からの二つの要素、ウイルス複製（のoriP）およびEB核抗原1（EBNA1）の起点を含むプラスミドです。 EBNA1エレメントは宿主細胞の分裂時のエピソームの分割を可能にする染色体DNAにoriPを含むプラスミドDNAを係留しながらのoriPエレメントは、哺乳動物細胞中でのプラスミドの複製を促進します。センダイウイルス（SV）およびRNAのトランスフェクションを含む他の統合フリーアプローチと比較して、電気自動車は、複数の利点5,6,10を有します。彼らは非常に手頃な価格、プラスミドDNAとしては、電気自動車は、容易に製造することができ、家の中で修正されました。また、EVに再プログラミングすることは、いくつかのRNAのトランスフェクションが成功した再プログラミングのために必要であるのに対し、電気自動車を持つ単一のトランスフェクションは、IPSCの世代のために十分であるため、少ない労働集約的なプロセスです。Dermal線維芽細胞は、多くの初期化研究に使用されてきました。しかし、皮膚生検は侵襲的で痛みを伴うプロセスだけでなく、再プログラミングのために十分な量に細胞を拡大するために時間がかかるだけではありません。大きな懸念されるのは、成人ドナーの皮膚細胞は、多くの場合、このように皮膚線維芽細胞11,12由来iPS細胞用のアプリケーションを制限し、腫瘍に関連する変異につながる可能性があり、長期UV光放射線にさらされてきました。最近、正常なヒトの皮膚細胞は強い正の選択13の下にあり、皮膚の扁平上皮細胞癌の主な要因のほとんどを含む、体細胞変異及び複数の癌遺伝子を蓄積することが報告されています。
1）血液細胞を容易に低侵襲的方法によって得ることができるので、皮膚線維芽細胞とは対照的に、末梢血（PB）細胞は、2）末梢血細胞は、造血幹細胞の子孫であり、再プログラミングのための細胞の好ましい供給源であります骨髄中に存在する、したがって、有害な放射線から保護。末梢血単核細胞（PBのMNC）は、フィコール – ハイパック（1.077グラム/ ml）を用いて、単純な勾配遠心分離後、バフィーコート層からの時間で収集することができます。得られたPBの多国籍企業は、リンパ球、単球およびいくつかの造血前駆細胞（HPCの）14から構成されています。ヒトTリンパ球は、PBの主要な細胞型の一つである成熟がT細胞は、T細胞受容体（TCR）遺伝子の再配列を含み、従って、アプリケーション15,16のための可能性を制限する完全なゲノムを欠いています。しかし、IPSCの生成を介してT細胞の活性化は、キメラ抗原受容体（CAR）T細胞療法17-19における潜在的な用途を有することができます。比較において、のHPCは、無傷のゲノムを有しており、容易に再プログラム可能です。わずか0.01が-末梢循環中の0.1％の細胞でのHPCであり、これらの細胞はerythrの増殖を有利赤血球培地中でex vivoで拡大することができますOID前駆細胞14。
我々の以前の研究では、PBの再プログラミングefficency 20で10倍に増加した山中因子（OCT4、SOX2、MYCおよびKLF4）に加えて、因子BCL-XLを使用していました。またBCL2L1として知られているBCL-XLは、カスパーゼ21,22の活性化を阻害することにより、細胞死の強力な阻害剤です。しかし、BCL-XLはまた、多能性21,22を維持する上で重要な役割を果たし得ます。最近、我々はさらに、別途再プログラミング効率23で約100倍増加につながる2つのベクトルでMYCおよびKLF4を発現させることにより、当社のEV再プログラミングシステムを最適化しました。健康なドナーからの0.5％ – この方法を使用して、トランスフェクション時の細胞数を開始することによって分割コロニー数で定義された再プログラミング効率は、0.2です。以下のように、我々はPBから統合フリーiPS細胞を生成するための詳細な実験手順を説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
健康なドナーや患者から血液サンプルを取得したことで、それ基礎研究および臨床細胞治療のための魅力的な細胞源作り、便利で非侵襲的です。ここでは、末梢血サンプルから統合フリーiPS細胞の非常に効率的に生成するためのプロトコルを記載しています。この再現性と手頃な価格のアプローチは、IPSCフィールドに利益をもたらすべきです。
我々は非常に効率PBの再?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Ministry of Science and Technology of China (2015CB964902, 2013CB966902 and 2012CB966601), the National Natural Science Foundation of China (81500148, 81570164 and 81421002), the Loma Linda University School of Medicine GCAT grant (2015), and Telemedicine and Advanced Technology Research Center (W81XWH-08-1-0697).
Materials
| Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | Sigma | S0192 | Store at 4 °C |
| Human stem cell factor (SCF) | Peprotech | 300-07 | Store at -20 or -80°C |
| Interleukin-3 (IL-3) | Peprotech | AF-200-03 | Store at -20 or -80°C |
| Eryrthropoietin (EPO) | Peprotech | 100-64 | Store at -20 or -80°C |
| Insulin growth factor-1 (IGF-1) | Peprotech | 100-11 | Store at -20 or -80°C |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Store at -20 or -80°C |
| 1-thioglycerol (MTG) | Sigma | M6145 | Store at -20 or -80°C |
| DMEM/F12 medium | Gibco | 112660-012 | Store at 4 °C |
| L-glutamine (100x) | Gibco | 25030-081 | Store at -20 °C |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Gibco | 15140-122 | Store at -20 °C |
| Non-essential amino acids solution (100x) | Gibco | 11140-050 | Store at 4 °C |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | Peprotech | 100-18B | Store at -20 or -80°C |
| ITS (100x) | Gibco | 41400-045 | Store at 4 °C |
| Ascorbic acid | Sigma | 49752 | Store at -20 °C |
| DMEM (high glucose) medium | Thermo | SH30243.01B | Store at 4 °C |
| FBS | Hyclone | SV30087.01 | Store at -40 °C |
| Ficoll | GE Healthcare, SIGMA | 17-5442-02 | Store at RT |
| Trehalose | Sigma | T9531 | Store at 4 °C |
| DMSO | Sigma | D2650 | Store at RT, protect from light |
| Endofree Plasmid Maxi Kit(10) | Qiagen | 12362 | Store at RT |
| IMDM | Gibco | 21056-023 | Store at 4 °C |
| Human CD34+ Cell Nucleofection Kit | Lonza | VPA-1003 | Store at RT, nucleofection buffer and supplement buffer should be stored at 4 °C |
| Sodium butyrate | Sigma | B5887 | Store at -20 or -80°C |
| ROCK inhibitor Y27632 | STEMGENT | 04-0012-10 | Store at -20 °C |
| Essential 8 basal medium (E8) | Gibco | A15169-01 | Store at 4 °C, the supplement should be stored at -20 or -80°C |
| Matrigel | BD | 354277 | Store at -20 or -80°C |
| 2x EasyTaq PCR SuperMix(+dye) | TransGen Biotech | AS111 | Store at -20 °C |
| Cell detachment solution | STEMGENT | 01-0006 | Store at -20 °C, Accutase as a cell detachment solution to obtain a single cell suspension |
| DAPI | Sigma | D9542-1MG | Store at 4 °C or -20 °C |
| Anti-nanog-AF488 | BD | 560791 | Store at 4 °C, primary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/100 when use |
| Anti-OCT4 | abcam | ab19857 | Store at 4 °C, primary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/100 when use |
| AF488 donkey anti-mouse IgG | Invitrogen | A21202 | Store at 4 °C, secondary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/500 when use |
| PE anti-human TRA-1-60-R Antibody | Biolegend | 330610 | Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry |
| eFluor 570-conjugated anti-SSEA4 | eBioscience | 41-8843 | Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry |
| Isotype antibody | eBioscience | 11-4011 | Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry |
| Alkaline Phosphatase Detection Kit | SiDanSai | 1102-100 | Store at 4 °C |
| Genomic DNA Extraction Kit | TIANGEN | DP304-02 | Store at RT |
| Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | Store at RT |
| Flow cytometry cell analyzer | BD | LSRII | for flow cytometry analysis |
| Spinning disk confocal microscope (SDC) | PerkinElmer | UltraVIEW VOX | for confocal imaging |
| Nucleofection device | Lonza | Nucleofector 2b | for the nucleofection of PB MNC |
| ImageQuant LAS-4010 | GE | take photo of AP staining in bulk |
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