Nach forcierter Expression mehrerer Transkriptionsfaktoren (Dh OCT4, SOX2, MYC und KLF4) können somatischen Zellen zu induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS – Zellen) umprogrammiert werden, die für Anwendungen ein großes Versprechen halten in der regenerativen Medizin und Zellersatztherapie ^1-3. Bisher wurden verschiedene Methoden entwickelt , um die Erfolgsrate der Umprogrammierung ^4-7 zu erhöhen. Virale Vektoren induzierte Reprogrammierung ist für eine effiziente Erzeugung von iPS-Zellen weit verbreitet, weil die virale Integration führt zu einem hohen Niveau, eine stabile Expression der Umprogrammierung Faktoren. Eine permanente Integration der Vektor – DNA in das Zellgenom induzieren Insertionsmutagenese ^5. Darüber hinaus kann unzureichende Inaktivierung von Reprogrammierungsfaktoren iPSCs Differenzierung ⁸ stören. Als solches ist der Einsatz von iPS-Zellen ohne Integration von Reprogrammierungsfaktoren zwingend notwendig, vor allem für den Einsatz in der Zelltherapie-Anwendungen.

<p class="jove_content"> Episomale Vektoren (EVs) sind bei der Erzeugung von Integrationsfreien iPSCs weit verbreitet. Das am häufigsten verwendete EV ist ein Plasmid , zwei Elemente enthält, die Herkunft der viralen Replikation (oriP) und EB Nuclear Antigen 1 (EBNA1), von dem Epstein-Barr (EB) -Virus ^9. Das oriP-Element fördert Plasmidreplikation in Säugetierzellen, während das EBNA1 Element den oriP-enthaltenden Plasmid-DNA in die chromosomale DNA anbindet, die für die Unterteilung des Episom während der Teilung der Wirtszelle ermöglicht. Im Vergleich zu anderen Integrationsfreien Ansätze, einschließlich Sendai – Virus (SV) und RNA – Transfektion besitzen EVs mehrere Vorteile ^5,6,10. Als Plasmid-DNA kann EVs leicht im Haus hergestellt und modifiziert werden, so dass sie äußerst erschwinglich zu machen. Darüber hinaus mit EV Umprogrammierung ist eine weniger arbeitsintensiver Prozess, da eine einzelne Transfektion mit EVs für iPSC Generation ausreichend ist, während mehrere RNA-Transfektionen für die erfolgreiche Reprogrammierung notwendig sind.

Dermal Fibroblasten wurden in vielen Umprogrammierung Studien verwendet worden. Allerdings ist Hautbiopsie nicht nur eine invasive und schmerzhafter Prozess, sondern auch zeitaufwendig für Zellen zu ausreichenden Mengen für eine Neuprogrammierung zu erweitern. Von größerer Bedeutung, Hautzellen von erwachsenen Spendern haben oft zu langfristigen UV – Licht – Strahlung ausgesetzt worden, die zu Mutationen , die mit Tumoren führen kann, so dass die Anwendungen für aus Fibroblasten der Haut ^11,12 abgeleitet iPSCs begrenzen. Kürzlich ist berichtet worden , dass normale menschliche Hautzellen und somatische Mutationen multiple Krebsgene ansammeln, einschließlich die meisten der Schlüsselfaktoren der kutanen squamösen Zellkarzinomen, sind unter starkem positiven Selektions ^13.

Im Gegensatz zu Hautfibroblasten, peripherem Blut (PB) Zellen eine bevorzugte Quelle von Zellen für eine Neuprogrammierung sind, weil 1) Blutzellen, können leicht durch eine minimal-invasive Verfahren, 2) periphere Blutzellen sind die Nachkommen von hämatopoetischen Stammzellen erhalten werden,im Knochenmark mit Wohnsitz, also vor schädlicher Strahlung geschützt. Periphere mononukleäre Blutzellen (PB MNCs) können in einer Stunde aus der buffy coat-Schicht nach einem einfachen Gradientenzentrifugation gesammelt werden unter Verwendung von Ficoll-Hypaque (1,077 g / ml). Die erhaltenen PB MNU sind aus Lymphozyten bestehen, Monozyten und einigen hämatopoetischen Vorläuferzellen (HPC) ^14. Obwohl menschliche T – Lymphozyten eine der Hauptzelltypen in PB sind, reifen T – Zellen enthalten Neuanordnungen der T – Zell – Rezeptor (TCR) Gene und fehlt somit eine intakte Genom ihr Potential für Anwendungen Begrenzungs ^15,16. Kann die Verjüngung von T – Zellen über iPSC Generation haben jedoch potenzielle Anwendungen in chimären Antigenrezeptoren (CAR) T-Zell – Therapie ^17-19. Im Vergleich dazu haben HPCs eine intakte Genom und sind leicht umprogrammierbar. Obwohl nur 0,01-0,1% der Zellen in den peripheren Kreislauf HPCs sind, können diese Zellen ex vivo in erythroiden Medium erweitert werden , die Proliferation von erythr begünstigtoid Vorläuferzellen ^14.

In unserer früheren Studie haben wir den Faktor BCL-XL zusätzlich zu den Yamanaka Faktoren (OCT4, SOX2, MYC und KLF4), die in einem 10 – fach Anstieg der PB Umprogrammierung efficency ²⁰ geführt. BCL-XL, die auch als BCL2L1 bekannt, ist ein potenter Inhibitor der Zelltod durch ^21,22 Aktivierung von Caspasen hemmen. Aber BCL-XL kann auch eine wichtige Rolle spielen Pluripotenz ^21,22 aufrechtzuerhalten. Vor kurzem haben wir unsere EV Umprogrammierung System mit zwei Vektoren durch separat exprimierenden MYC und KLF4 optimiert, was in Umprogrammierung Wirkungsgrad ²³ auf eine etwa 100 – fache Steigerung führt. Unter Verwendung dieses Verfahrens wird die Umprogrammierung Effizienz, definiert durch Koloniezahl geteilt durch die Zellzahl bei der Transfektion ausgehend ist 0,2-0,5% von gesunden Spendern. Wie folgt beschreiben wir die detaillierte experimentelle Verfahren zur Erzeugung von Integration freien iPSCs von PB.