Summary

Dextran Murine 및 인간의 기본 NK 세포의 Lentiviral 변환 효율 향상

Published: January 15, 2018
doi:

Summary

이 연구의 목표는 기본 자연적인 살인자 (NK) 세포에서 성공적인 유전자 변환에 대 한 허용 하는 기술을 공식화 했다. 인간의 lentiviral 변환 dextran 중재 또는 더 높은 유전자 식 효율성에 마우스 기본 NK 세포 결과. 이 방법은 유전자 변환의 NK 세포 유전자 조작을 향상 방대 하 게 됩니다.

Abstract

자연적인 살인자 (NK) 세포에 특정 유전자의 효율적인 변환 주요 도전 하고있다. 성공적인 transductions는 개발, 차별화, 및 NK 세포의 기능에 관심사의 유전자의 역할을 정의 하는 데 중요 합니다. 암 immunotherapy에 공상 항 원 수용 체 (자동차)에 관련 된 최근의 진보 effector 세포에 세 유전자를 전달 하는 효율적인 방법에 대 한 필요성을 강조 합니다. 기본 인간 또는 마우스 NK 세포 중재 lentiviral 유전자 transductions의 효율성 유지 크게 낮은 주요 제한 요인입니다. 최근 진보 양이온 중합체, polybrene, 등을 사용 하 여 T 세포에서 향상 된 유전자 변환 효율을 표시 합니다. 그러나, 이러한 제품 NK 셀의 변환 효율을 개선 하지 못했습니다. 이 작품 보여줍니다 그 dextran, 분기 글 루 칸 다 당 류, 크게는 인간의 변환 효율 및 마우스 기본 NK 세포 향상 됩니다. 이 높은 재현성 변환 방법론 인간의 기본 NK 세포, 임상 유전자 배달 응용 프로그램 및 따라서 NK 세포 기반 암 immunotherapy. 훨씬 향상 시킬 수 있는 시험을 위한 유능한 도구를 제공 합니다.

Introduction

자연적인 살인자 (NK) 세포는 타고 난 면역 시스템1의 주요 림프모구 인구. NK 세포는 종양과 감염2,,34에 대 한 호스트 면역 반응의 첫 번째 라인 수비수로 작동합니다. NK 세포는 또한 발산5와 강력한 cytokines의 분 비를 통해 관용의 개발에 중심 역할을 한다. 종양 세포를 대상으로 그들의 강력한 능력으로 인해 여러 임상 시험 암6,7에 대 한 입양 immunotherapy로 인간 NK 세포 기증자 파생 된을 평가 하기 위해 실시 되고있다. 달리 T 세포, NK 세포의 발달 생물학이 있다 아직 잘 특징8. 지식의이 부족은 부분적으로 마우스 또는 인간의 기본 NK 세포의 유전자를 전달 하는 효율적인 기술의 부재 때문입니다. 이러한 이유로 대부분의 NK 세포 연구 1 차 셀 대신 셀 라인에서 실시 되었습니다. 따라서, 안정적이 고 효율적인 프로토콜 transduce 기본 NK 세포의 유전자에 대 한 필요성은 중요 합니다.

이 연구의 전반적인 목표는 기본 인간 또는 murine NK 세포 lenti-또는 레트로 바이러스 불리고 수 있는 일관 되 고 신뢰할 수 있는 방법을 공식화 했다.

이 문제를 해결 하려고 하는 이전 연구, 크게 기본 NK 세포의 과도 변화를 사용 하 여 수행 되었습니다. 이 플라스 미드 transfection9,10, 엡 스타인-바 바이러스 (EBV) 포함 / 하이브리드 retroviral 벡터11, vaccinia 벡터12,13및 Ad5/F35 공상 adenoviral 벡터14. 이러한 기술의 겸손 한 효율성에도 불구 하 고 변환의 과도 특성은 그들이 유전자 변형된 NK 세포의 장기 활용에 적합 합니다. 몇 가지 최근 연구 transduce NK 세포, 감염 유전자 표현11,15의 수락 가능한 수준을 달성 하기의 여러 주기를 요구를 retroviral 벡터를 사용 했습니다. Retroviral 벡터, 달리 lentiviral 벡터는 바이러스 사전 통합 복잡 한 핵으로 이동 하 호스트 세포 핵 가져오기 기계를 사용할 수 있습니다. 이것은 기본 NK 세포를 포함 하는 비 분열 세포에서 바이러스의 복제에 주요 제한 요소 이다.

다른 세포 표면 수용 체와 바이러스 성 입자 사이 상호 작용 셀으로 바이러스 성 통풍 관을 허용합니다. 바이러스 성 봉투 단백질 및 그들의 동족 호스트 수용 체 사이의 초기 계약이 두 가지 사이의 기존 잠재적인 부정적인 요금 때문에 제한 될 수 있습니다. 많은 변환 기법 뒤에 근거는 polybrene (Pb), protamine 황산 (PS), 등 dextran, 양이온 중합체의 세포 표면 수용 체에 포지티브 차지를 줄 수 있고 그로 인하여 증가 바이러스 성 봉투의 바인딩 단백질입니다. 이 셀16퓨전 효율성과 바이러스 성 입자의 통풍 관을 증가할 것 이다. Pb 또는 PS 향상 시킬 수 있는 T 세포17에 유전자 이동으로 보고 되어, 그들의 응용 프로그램 없 어떤 효과 기본 NK 셀의 변환 효율에서. 또한, 기본 NK 세포를 사용 하 여 이러한 시 약 사이의 비교 분석 하지 수행 되었습니다. 이 연구에서는 3 개의 양이온 중합체의 변환 효율성 비교 되었다. 결과,이 3 개의 양이온 폴리머 중 dextran만 크게 향상 마우스 및 인간의 기본 NK 세포로 효율적인 바이러스 성 변환 보여.

Protocol

모든 동물 프로토콜 동물의 자비 롭 고 윤리적인 치료를 따 랐 고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 내는 생물 의학 연구 센터 (BRC) 의학 대학 위스콘신 (MCW), 밀워키, 위스콘신에 의해 승인 했다. 인간 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)를 사용 하 여 혈액 센터 위스콘신, 밀워키, 위스콘신의 혈액 연구소의 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 승인 되었다. 1. 마우스, 셀 라인, 및 벡터 <li…

Representative Results

Dextran 유도 lentiviral 벡터 기본 인간과 murine NK 세포에서의 효율적인 유전자 이동 인간 NK 세포 격리 및 (85% 이상의 순도)와 PBMC에서 정화 되었고 rIL-2 300 U/mL와 함께 밤새 껏 알을 품. 이러한 기본 NK 세포 감염의 다양 한 복합성에 GFP lentivirus로 불리고 다음 했다 (나; 3, 10, 및 셀 20 IU) 8 µ g/mL Pb, PS, 또는 dextran 있을 때 24-잘 접시에. 셀 60…

Discussion

이 연구는 양이온 폴리머 에이전트 murine 및 인간의 기본 NK 세포의 lentiviral 변환 효율 향상 dextran의 사용 하는 보여줍니다. 또한, 다른 양이온 대리인, Pb 등 PS, 아무 인지할 수에 영향을 바이러스 성 벡터의 기본 인간 NK 세포에. 이전에, Pb 인간 T 세포17에 유전자 변환 증가 수 있습니다 입증 되었습니다. 그러나 이러한 결과, Pb도 PS 기본 인간 NK 세포에 비슷한 효율을가지고 제안. 이…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 루시아 Sammarco와 그녀의 룰 루의 레모네이드 스탠드 영감, 동기 부여, 및 지원을 위한 감사합니다. 이 작품은 NIH R01 AI102893와 NCI R01 CA179363 (S.M.);에 의해 부분적으로 지원 NHLBI-HL087951 (S.R.); NIH-CA151893-K08 (M.J.R.); NCI 1R01CA164225 (L.W); 알렉스 레모네이드 스탠드 재단 (S.M.); MACC 기금 (S.M.;의 HRHM 프로그램 S.R.; M.S.T); 니콜라스 가족 재단 (S.M.); Gardetto 가족 (S.M.); 현대 학자 (M.S.T.) 프로그램; 바퀴 (S.R.);에 현대 희망 MACC 기금 (M.S.T. 및 S.M.); 어린이 연구소, MCW (S.R.); 그리고 캐시 Duffey Fogerty 수상 (M.J.R.).

Materials

Dextran Sigma-Aldrich 90-64-91-9
polybrene (Pb) Sigma-Aldrich TR-1003
protamine sulfate (PS) Sigma-Aldrich p3369
Trypsin Corning 25-052-CI
RPMI1640 Corning 10-040-CV
Fetal Bovine Serum ATALANTA S11150
Penicillin Corning 30-001-CI
B-mercaptoethanol SIGMA M3148
sodium pyruvate Corning MT25000CI
Interferon gamma (IFN-γ ) eBioscience 14-7311-85
Propidium lodding staining solution BD 51-66211E
Lipofectamine 3000 Thermo Fisher L3000015
Isoflurane PHOENIX NDC 57319-559-05
NK cell negative selection kit Stem Cell 19855
Yac-1 ATCC TIB-160
K562 ATCC CCL-243
Mice Jakson 664
293T cells ATCC CRL-3216
T75 flasks Cornnig 430641U
antibody-based negative selection kits Stem Cell 19055
51Chromium (Cr)-release assays perkin elmer's NEZ030
ELISA kits Ebioscience 00-4201-56
Sodium Butyrate Sigma 5887-5G
Linear polyethylenimine polysciences 23966-2
Ficoll GE Life Science 17-1440-03
HBSS Corning 21-022-CV

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Citar este artigo
Nanbakhsh, A., Best, B., Riese, M., Rao, S., Wang, L., Medin, J., Thakar, M. S., Malarkannan, S. Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells. J. Vis. Exp. (131), e55063, doi:10.3791/55063 (2018).

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