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Biologia

Isolement et caractérisation de microvésicules dans le sang périphérique

Published: January 06, 2017
doi:
10.3791/55057
, , , ,
1Department of Hematology/Medical Oncology,University Medical Center Göttingen

Summary

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

Abstract

La libération de vésicules extracellulaires (VE) y compris les petites exosomes endosomes dérivés (Exos, diamètre <100 nm) et microvésicules membranaires dérivées grand plasma (MVs, diamètre> 100 nm) est un processus cellulaire fondamental qui se produit dans toutes les cellules vivantes. Ces protéines de transport des vésicules, des lipides et des acides nucléiques spécifiques pour leur cellule d'origine et dans les études in vitro ont mis en évidence leur importance en tant que médiateurs de la communication intercellulaire. Véhicules électriques ont été isolés avec succès à partir de divers fluides corporels et en particulier les véhicules électriques dans le sang ont été identifiés comme biomarqueurs prometteurs pour le cancer ou les maladies infectieuses. Afin de permettre l'étude des sous-populations MV dans le sang, nous présentons un protocole standardisé pour l'isolement et la caractérisation des MVs à partir d'échantillons de sang périphérique. MVs sont sédimentées à partir d'échantillons de plasma EDTA anticoagulé par centrifugation différentielle et possèdent typiquement un diamètre de 100-600 nm. En raison de leur plus grande taille, ils peuventêtre facilement étudiée par cytométrie de flux, une technique qui est couramment utilisée dans le diagnostic clinique et dans la plupart des laboratoires. Plusieurs exemples de tests de contrôle de la qualité des MVs isolés seront donnés et des marqueurs qui peuvent être utilisés pour la discrimination des différentes sous-populations MV dans le sang seront présentés.

Introduction

Au cours des dernières années , plusieurs études in vitro ont démontré que les vésicules extracellulaires (VÉ) jouent un rôle important dans la communication intercellulaire. Les cellules vivantes ne cessent de répandre des vésicules qui diffèrent par la taille, le contenu et la biogenèse. Les véhicules électriques les mieux étudiés sont exosomes qui proviennent du système endosomal où ils sont stockés sous forme de vésicules intraluminaux dans les corps multivésiculaires. Une fois que celui – ci fusionnent avec la membrane plasmique, les vésicules contenues sont libérés comme exosomes (Exos, diamètre 30-100 nm 1). Une deuxième population de EV qui a attiré l' attention de plus en plus dans les dernières années sont grandes microvésicules (MVs, diamètre 100 – 1000 nm) qui bourgeonnent hors directement à partir de la membrane plasmique 2.

Les deux types de vésicules sont entourées d'une double couche lipidique et contiennent des acides nucléiques, par exemple, l' ADN, l' ARNm ou miARN 3 – 5, et une grande variété de protéines qui peuvent transférer à c voisinaunes. Alors qu'en général , la composition protéique des vésicules reflète l'état de la cellule d'origine, certaines protéines semblent être ciblées de manière sélective et enrichie sur EV 1. Un intérêt majeur de recherche est de caractériser les véhicules électriques à partir de cellules anormales et malades, afin de définir des signatures EV spécifiques qui pourraient permettre l'utilisation de véhicules électriques en tant que nouveaux biomarqueurs. Surtout dans le cancer, où souvent la tumeur elle – même ne sont pas facilement accessibles, les biopsies liquides ciblant les véhicules électriques spécifiques de la tumeur dans le sang pourraient permettre un suivi des réponses thérapeutiques ou aider à caractériser la tumeur primaire sans la nécessité de procédures invasives 6.

En effet, les véhicules électriques ont déjà été isolés avec succès à partir de divers fluides corporels , y compris l' urine 7, 8 CSF, le lait maternel 9 ou de sang 10. Plusieurs études ont identifié des changements dans le nombre de EV et la composition de différentes maladies humaines. Par exemple, chez les patients atteints de sepsis le nombre de MVs pro-coagulantaugmenté de manière significative par rapport à des personnes en bonne santé 11. Aussi chez les patients atteints de paludisme cérébral grave une augmentation de MVs totales dans le sang peut être observée et les chiffres de MVs dérivées des plaquettes en corrélation avec la profondeur de coma et de thrombocytopénie 12. D' autres études indiquent un nombre élevé de vésicules d' origine endothéliale chez les patients atteints de lupus érythémateux disséminé ou une insuffisance cardiaque et dans le cas de ce dernier, cette corrélation avec une probabilité plus élevée d'événements cardiovasculaires 13,14.

Surtout dans le cancer, les véhicules électriques dans le sang sont actuellement discutées en tant que nouveaux biomarqueurs ayant une valeur diagnostique et pronostique. Les niveaux de MVs exprimant des protéines associées à des tumeurs , tels que MUC1, l' EGFR ou FAK semblent être élevée dans le sang des patients atteints d' un cancer du sein 15,16. Aussi pour Exos, des études récentes ont montré que les Exos dérivés du sang portant des antigènes spécifiques de tumeurs tels que Glypican-1 pour le cancer du pancréas ou Del-1 pour le cancer du sein précoce de la maladie permet deprotection avec une haute spécificité et la sensibilité 17,18. En outre, la tumeur dérivée du sérum Exos peut contenir de l' ADN qui peut être utilisé pour la détection de mutations telles que KRAS et p53 ce qui suggère leur utilisation pour la prédiction de la thérapie 19. Des progrès récents ont montré que l' analyse de Exos dans le sang des patients atteints de glioblastome en utilisant une puce microfluidique spécifique permet le suivi de la thérapie 20. Pris ensemble, ces résultats impliquent que l'analyse des sous-populations spécifiques de la maladie de vésicules donne des informations précieuses sur le diagnostic, le pronostic ainsi que des options thérapeutiques et de succès.

Cependant, l'isolement et l'analyse des Exos du sang est temps, nécessite un équipement de laboratoire spécial et est donc pas encore adapté pour le diagnostic clinique de routine. En revanche, on peut isoler MVs beaucoup plus rapide et, en raison de leur grande taille, peuvent être facilement analysées par cytométrie en flux sans qu'il soit nécessaire de les coupler à des billes de latex , comme il est nécessaire pour 18 Exos21. Ainsi, nous présentons ici un protocole qui peut être utilisé pour l'isolement normalisé de MVs à partir d'échantillons de sang et de la caractérisation ultérieure des sous-populations MV par cytométrie de flux. Ce protocole permettra à l'étude plus en profondeur et caractérisation des profils MT dans les grands groupes de patients qui seront nécessaires afin d'utiliser MVs pour les diagnostics cliniques de tous les jours.

Protocol

Toutes les expériences, y compris des sujets humains ont été approuvés par le comité d'éthique local (approbation no. 02.03.14). Pour le choix des patients , il convient de noter que plusieurs facteurs tels que l' âge, le sexe, les schémas thérapeutiques actuels et beaucoup d' autres peuvent influencer la composition MV dans le sang et doivent donc être pris en considération avant la collecte 22,23 échantillonner. 1. Préparation des échantillons de plasma Dessinez 1 – 2 tubes de sang par donneur à travers une aiguille de papillon de calibre 21 dans un tube de collecte de sang Vacutainer contenant de l'EDTA (1,6 mg / ml de sang). Assurez-vous d'inverser le tube (s) plusieurs fois pour garantir l'efficacité anticoagulation du sang. NOTE: Le volume recommandé de sang pour la cytométrie de flux et d'analyse ultérieure Western Blot est de 5 – 15 ml. Afin de prévenir la dégradation de MV et de la perte, des échantillons de sang doivent être manipulés <30 min après le retrait du sang. Préparer des échantillons de plasma par centrifugation des échantillons pendant 15 min à 1200 g àla température ambiante (RT). Appliquer un filtre de soupape afin d'aider à la séparation du plasma (= couche supérieure) de rester cellules sanguines (= couche inférieure). Transférer le plasma dans un tube de 15 ml. Centrifuger pendant 15 min à 1500 xg, RT à sédimenter les débris cellulaires plus grande et éliminer les plaquettes restantes. Transférer le surnageant dans un tube de 15 ml et procéder directement à des échantillons d'isolement ou de magasin MV pour un maximum de 6 mois à -20 ° C. NOTE: Le protocole présenté peut également être utilisé pour isoler et MVs (Exos) à partir de surnageants de culture cellulaire. Afin de le faire, de cultiver des cellules à 60 – 80% de confluence pendant 24 – 48 h dans un milieu de culture additionné de vésicules appauvri FCS, puis recueillir le surnageant. Centrifuger pendant 5 min à 750 x g, 4 ° C pour éliminer les cellules résiduelles flottantes, de remplir le surnageant dans un nouveau tube et on centrifuge 15 ml de nouveau pendant 5 min à 1500 x g, 4 ° C pour sédimenter les débris cellulaires plus grande. Ce surnageant peut ensuite être utilisé pour l'isolement de MVscomme décrit à l'étape 2.1 à 2.16. 2. Isolement de MVs Transférer l'échantillon de plasma dans un tube approprié à la centrifugation. Si nécessaire, remplir le tube avec du PBS afin de diluer l'échantillon et éviter l'effondrement des tubes à paroi mince au cours de la procédure de centrifugation. Centrifugeuse pendant 35 min à 14000 xg, 4 ° C. Décanter le surnageant, garder tubes tournés à l'envers et mis sur une serviette en papier. Attendez 3-5 min jusqu'à ce que tout surnageant restant a été trempé dans la serviette et ainsi retiré de l'échantillon. Remettre en suspension le culot dans MV 1000 pl de PBS, transvaser dans un tube de centrifugeuse et 1,5 ml pendant 35 min à 14 000 xg, 4 ° C dans une centrifugeuse de table. surnageant Aspirer. Remettre en suspension le culot MV dans 50-500 ul de PBS, en fonction de la taille de la pastille. En variante, MVs lyser directement, par exemple dans un tampon RIPA (NaCl 150 mM / 0,1% SDS / 0,5% de Na-désoxycholate / 1% de Triton X-100/50 mM de Tris, pH 7,2)pour analyse ultérieure Western Blot. MVs Conserver à -20 ° C. Ils resteront stables pendant plusieurs mois, mais il faut éviter de gel-dégel-cycles répétés. Facultatif: Déterminer la concentration en protéines MV avec un dosage de protéines (par exemple, Bradford ou méthode de Lowry) afin d'évaluer le rendement MV ou dose MVs pour les expériences ultérieures. Si Exos supplémentaires doivent être isolés à partir des échantillons de plasma, décanter le surnageant de l'étape 2.3 dans un tube d'ultracentrifugation et centrifuger pendant 2 h à 110 000 x g, 4 ° C. Décanter le surnageant comme décrit à l'étape 2.3, resuspendre Exo culot dans 1000 ul de PBS et transférer dans les petites (1,5 ml) tubes d'ultracentrifugation. Ultracentrifugeuse pendant 2 h à 110.000 xg, 4 ° C, aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans Exo 50-75 ul de PBS ou de tampon RIPA. 3. Caractérisation des MVs par cytométrie de flux Transfert 15 pl de PBS + 1% de sérum de veau fœtal appauvri en vésicules (FCS) dans un tube de cytométrie de flux. REMARQUE: Vésicules appauvri FCS est préparé par centrifugation inactivé par la chaleur (30 min à 56 ° C) de FCS pendant 18 h à 110 000 x g et le surnageant filtration à travers un filtre de 0,2 um , comme décrit précédemment 24. Ajouter 5 ug (en cas de faibles rendements 3 pg sont également applicables) de MVS dans PBS. Incuber les échantillons pendant 30 min à température ambiante afin de bloquer les sites de liaison non spécifique à la surface MV et réduire ainsi la coloration de fond. Ajouter un anticorps marqué par fluorescence contre l'intérêt des protéines de. Titrer la quantité d'anticorps utilisé pour la coloration avant leur utilisation afin de déterminer la concentration optimale et d'assurer une ration faible rapport signal à bruit. Assurez – vous d'inclure également un tube avec MVs non colorées comme contrôle négatif et un tube de MVs colorées avec l'anticorps correspondant de contrôle isotypique à la même concentration (par exemple, si 1 ug d'anticorps est utilisé, utiliser également 1 pg de l'un de contrôle isotypiquetibody) pour quantifier la coloration de fond. NOTE: Il est également possible d'effectuer des flux multicolore cytométrie en ajoutant plusieurs anticorps couplés à des fluorochromes différents. Incuber pendant 20 min à température ambiante dans l'obscurité. Ajouter 250 ul de PBS et procéder à la mesure de l'échantillon à l'aide d'un cytomètre de flux. Dans le cas où les échantillons ne peuvent pas être mesurés immédiatement, ajouter 150 ul de PBS et 50 pi 4% de paraformaldehyde (PFA) pour fixer les échantillons et les stocker à 4 ° C. ATTENTION: PFA est toxique. Utiliser des gants et un équipement de protection individuelle appropriés. Réduire le seuil de la cytométrie de flux à la valeur la plus faible possible et la recherche de la population MV en utilisant une diffusion vers l'avant (FSC) par rapport à la diffusion latérale (SSC) tracé en échelle logarithmique. Porte sur la population MV et évaluer le signal fluorescent dans un histogramme correspondant. 4. Caractérisation des MVs par Western Blot Resuspendre le culot MV directementun tampon de lyse approprié (par exemple un tampon RIPA). Dans le cas où le culot MV a déjà été remis en suspension dans du PBS, diluer au moins 1: 1 dans un tampon de lyse approprié (par exemple un tampon RIPA). Déterminer la concentration en protéines de l'échantillon MV, par exemple, par un dosage de Lowry. Préparer 10 – 20 pg de MVS dans 22,5 pi de tampon RIPA. Puis ajouter 7,5 pi 4x Laemmli tampon de charge et de la chaleur pendant 5 min à 95 ° C. Charger les échantillons sur un gel de polyacrylamide et immuno-électrophorèse et effectuer conformément à des protocoles standard. Après le transfert des protéines sur la membrane, effectuer une coloration de Ponceau en tant que témoin de chargement selon les protocoles standards. Membrane Destain dans du TBST pendant 5 min à température ambiante. membrane de bloc pendant 30 minutes jusqu'à 1 h à température ambiante dans 5% de BSA dans TBST. Incuber la membrane avec l'anticorps primaire à 4 ° C pendant une nuit ou pendant 2 h à température ambiante. Laver la membrane avec TBST 3 x 5 min. Incuber la membrane avec l'anticorps secondaire couplé à la HRP à une dilution de 1: 10 000 dans 5% de BSA. Remarque: En cas de signaux de fond élevés, utiliser du lait en poudre au lieu de BSA. Laver la membrane avec TBST 3x 5 min. Développer la membrane avec un réactif de détection ECL et à détecter des signaux sur des films de chimioluminescence ou d'un système d'imagerie par chimiluminescence. NOTE: Afin de discriminer MVs de Exos, protéines comme tubuline, actinine-4 ou mitofilin peut être utilisé qui devraient principalement être présents sur MVs 16,25. Faites attention que les anticorps les plus tétraspanines (par exemple, CD9, CD81), utilisés comme marqueurs pour Exos, ne fonctionnent pas dans des conditions réductrices et doivent donc être préparés dans un tampon non-réduction de la charge suivie par un chauffage pendant 10 min à 70 ° C.

Representative Results

Afin de quantifier le rendement de MVs qui peuvent être isolées suivant le protocole décrit, nous avons calculé la quantité de MVs isolées à partir d'échantillons de sang de 10 donneurs. Le rendement MV, qui a été évaluée dans un dosage de protéines Lowry, variait de 10 à 30 ug avec une moyenne de 19,2 pg MVs par mL de sang (tableau 1). La concentration en particules , déterminée par analyse de suivi de nanoparticules (NTA) varie de 1,66 x 10 9 à 2,36 x 10 10 , avec une moyenne de 5,9 x 10 9 particules par mL de l' échantillon plasmatique (tableau 2). Une caractérisation plus poussée des MVs par microscopie électronique à transmission a révélé une population de vésicules ayant un diamètre> 100 nm , qui sont entourés par une bicouche lipidique et ne contiennent pas de organelles cellulaires (figure 1A). NTA a confirmé que la taille des MVs isolés variait de 100 à 600 nm (figure 1B) et la taille moyenne était de 201 MVnm (figure 1C). Coloration pour MV et exo marqueurs typiques par Western blot a démontré que les MVs isolés étaient positifs pour tubuline et seulement ont montré une légère expression de CD9 et CD81, alors que Exos étaient négatifs pour tubuline et enrichi en CD9 et CD81 (Figure 2). L' analyse des MVs isolées par cytométrie de flux (figure 3A) a révélé une population de vésicules définie qui peut être fermée en utilisant les mêmes paramètres normalement utilisés pour MVs isolés à partir de surnageants de culture cellulaire et qui était clairement différent du signal de référence obtenu par la mesure du PBS + 1% des vésicules appauvries FCS sans addition de MVs (figure 3B). Afin d'analyser les différentes populations MV présentes dans le sang, MVs ont été colorées avec des marqueurs établis pour les différentes populations de cellules sanguines, par exemple, CD62P pour MVS dérivées des plaquettes, CD45 pour MVS leucocytaires dérivés, CD235a pourMVs et CD62E globules rouges-dérivée pour MVs dérivés de cellules endothéliales (Figure 4). Cette caractérisation a montré que le pourcentage des sous-populations MV différait parmi les échantillons de sang des donneurs étudiés, alors que la majorité des MVs semblait être versé par les plaquettes dans tous les échantillons. Figure 1: Distribution de la taille des MVs isolés du sang périphérique. A, MVs isolés ont été visualisées par microscopie électronique à transmission. B, analyse de suivi représentatif de nanoparticules (NTA) de MVs illustrant la distribution de la taille des vésicules. C, La taille moyenne de 10 MV préparations indépendantes a été mesurée par NTA (moyenne). S'il vous plaît cliquer ici pour voir alVersion Arger de ce chiffre. Figure 2: Caractérisation des MVs isolés par Western Blot. expression de la protéine différentielle sur les MVs isolées et Exos de deux donneurs a été visualisée par Western Blot. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 3: Analyse par cytométrie de flux MVs. A, MVs sont d' abord visualisées sur l' avant (FSC) par rapport à sidescatter (SSC) parcelles à la porte sur la population MV respective. Par la suite, ces MVs sont caractérisés par l'antigène d'intérêt par en utilisant des anticorps marqués par fluorescence dirigés contre l'antigène. B, typique FSC par rapport parcelles SSC pour MVs isolés du plasma de deux donateurs. A titre de comparaison, un tracé typique de la tumeur MVs dérivées de cellules à partir de cellules de cancer du poumon A549 isolées à partir de surnageant de culture cellulaire ainsi qu'un contrôle négatif en utilisant uniquement PBS + 1% vésiculaire appauvri FCS sans MVs sont présentés sur la droite. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 4: Caractérisation des MVs isolés par cytométrie de flux. MVs provenant de trois donneurs ont été caractérisées par l'expression de marqueurs de cellules sanguines établies (rouge) par cytométrie de flux. Les contrôles isotypiques respectifs sont indiqués en gris.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig4large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Échantillon Sang MVs / mL [pg] #1 29.4 n ° 2 10.3 N ° 3 15.2 N ° 4 31.1 N ° 5 18,8 n ° 6 22,7 #7 19.1 n ° 8 18,7 # 9 15.0 #dix 11.9 Tableau 1: MV Protein Rendement d'échantillons de sang périphérique. </strong> Montré est la quantité de MVs par ml de sang périphérique qui a été tirées de 10 donateurs. Les rendements MT ont été quantifiées par dosage de Lowry. Échantillon MVS / ml de plasma [nombre de particules] #1 6.42E + 09 n ° 2 2.36E + 10 N ° 3 1.88E + 09 N ° 4 6.51E + 09 N ° 5 3.48E + 09 n ° 6 4.57E + 09 #7 2.09E + 09 n ° 8 1.66E + 09 # 9 2.54E + 09 #dix 6.20E + 09 Tableau 2: MV particules Rendement d'échantillons de sang périphérique. </stRong> MV ont été isolés à partir d'échantillons de plasma de donneurs 10 et le nombre de particules ont été déterminées par analyse de suivi des nanoparticules. On a représenté la valeur moyenne de trois mesures indépendantes.

Discussion

Des études récentes sur les véhicules électriques dans le sang ont démontré que la composition et les chiffres EV changent au cours de la cause de plusieurs maladies. Par conséquent, l'analyse et une caractérisation plus poussée de ces véhicules électriques sont d'un grand intérêt pour mieux évaluer leur utilisation potentielle comme biomarqueurs de la maladie pour le diagnostic et le pronostic ou pour évaluer les réponses thérapeutiques. Le protocole que nous présentons ici permet l'isolement des vésicules ayant un diamètre allant jusqu'à 600 nm, ce qui ne contiennent pas des organites cellulaires. Ces observations sont conformes à la définition actuelle de MVs et excluent la présence de corps apoptotiques 2. Utilisation de Western blot, nous avons pu démontrer que les MVs isolés montrent une forte expression de la tubuline, tandis que les tétraspanines CD9 et CD81 qui sont souvent utilisés comme marqueurs ont été légèrement Exo exprimés. Cela confirme que MVs diffèrent de Exos et correspond à la récente caractérisation et la comparaison des deux populations EV en profondeur par protéomique 25.

content "> Lors de l'acquisition d'échantillons de sang, il est essentiel de conserver le temps entre les prises de sang et de la préparation de plasma aussi courte que possible afin d'éviter la dégradation de MV. En outre, un stockage prolongé des échantillons de sang peut conduire à l'activation des cellules sanguines provoquant une meilleure MV verser et, finalement, l'apoptose qui conduit à la libération des corps apoptotiques. Une autre considération importante pour MV isolement pour prévenir les contaminations de préparations MV avec des protéines plasmatiques ou plus petites Exos. par conséquent, il est essentiel d'éliminer autant de surnageant que possible après centrifugeant MVS à 14.000 x g. Depuis le culot est normalement visible et bien fixé à la paroi du tube, le surnageant peuvent être facilement enlevés avec une pointe de pipette. contrairement à Exos qui ont tendance à former des agrégats lors de la préparation par ultracentrifugation à haute vitesse et sont souvent difficiles à remettre en suspension, ce problème ne se produit pas avec MVs.

Notre étude montre qu'il est possible pour caractériser des sous-populations MV présentes dans le sang par cytométrie de flux. Bien que la limite de détection de la plupart des cytomètres de flux est d'environ 200-300 nm, MVs ont été mesurées dans reproductible des donateurs ainsi que des échantillons de culture de cellules avec les mêmes paramètres d'analyse et de portes qui permettaient clairement leur distinction à partir de signaux d'arrière-plan. Il est important de vérifier avant les mesures que le système de fourchettes utilisées pour les analyses ne contient pas de particules contaminantes qui pourraient causer un bruit de fond élevé lors de la cytométrie de flux (Figure 3). Bien que certains petits MVs pourraient ne pas être pris dans une approche de cytométrie de flux, nous avons détecté MVs de toutes les grandes populations de cellules sanguines (par exemple, les plaquettes, les globules rouges, les leucocytes, les cellules endothéliales). Dans nos analyses , nous avons utilisé des marqueurs standards pour les différentes cellules sanguines qui ont été précédemment trouvés sur MVs 26 – 29. Il convient de noter que, afin d'obtenir les meilleurs résultats possibles par cytométrie en flux, til quantité et la concentration de tous les anticorps doivent être titrés sur un échantillon MV exprimant l'antigène d'intérêt. Si les sous – populations MV spécifiques dans le sang doivent être identifiés avec une spécificité plus élevée, il est possible d'effectuer une double coloration contre deux antigènes différents présents sur les MVs respectifs et seulement envisager toutes les MVs doubles positifs pour des analyses ultérieures 23. À l' heure actuelle, il y a des efforts pour définir une gamme standard de sous – populations MV dans le sang d'individus sains 23,30. Ces études ont déjà montré que MVs dérivées des plaquettes constituent la plus grande population de MVs dans le sang qui est en correspondance avec nos observations.

Un avantage de la cytométrie de flux pour caractériser des échantillons MV est que cette méthode est déjà bien établie à des fins de diagnostic dans la plupart des centres cliniques qui permettraient l'utilisation possible de MVs comme biomarqueurs dans le diagnostic clinique de tous les jours. Des études antérieures sur les véhicules électriques dans le sang qui ont surtout l'accented sur les petits Exos, reposent soit sur des procédures de tri spécifiques pour analyser sélectivement la exo population cible souhaitée 31,32 ou nécessitent un (2 jours) processus d'isolement de temps avec couplage de Exos à billes de latex avant l'analyse 18. Nos propres observations non publiées suggèrent que l'analyse cytométrique d'écoulement de MVs à partir de préparations de sang total permet même la détection de MVs tels que MVs dérivées de tumeurs sans de tels procédés de sélection.

Pris ensemble, le protocole présenté ici permet l'isolement rapide de MVs à partir d'échantillons de sang périphérique avec un équipement de laboratoire standard et leur caractérisation ultérieure en utilisant la cytométrie de flux et Western blot. L'ensemble du processus peut être effectuée dans environ 2 h, ce qui facilitera les futures études sur les profils MT dans le sang des patients qui sont nécessaires pour évaluer le potentiel de MVs comme biomarqueurs de la maladie.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors acknowledge Meike Schaffrinski for excellent technical assistance. We would like to thank the following people for their help in the collection of peripheral blood samples (all from University Medical Center Göttingen): Henrietta Vida (Dept. of Transfusion Medicine), Kia Homayounfar, Lena-Christin Conradi (Dept. of General, Visceral and Pediatric Surgery), Leila Siam, Bawarjan Schatlo (Dept. of Neurosurgery), Hendrik A. Wolff, Martin Canis (Dept. of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery) as well as all employees of the interdisciplinary short-term oncology. We acknowledge Dirk Wenzel (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, Göttingen) for his help with the electron microscopy of MVs.

The study was funded by the German Ministry of Education and Research (BMBF) project MetastaSys (grant no. 0316173) as well as the German Cancer Aid (grant no. 109615).

Materials

butterfly needle (21 gauge) Hospira Deutschland GmbH 490P29201
Bovine serum albumin Fraction V Roth 8076.3 For 10x TBS weigh 24.2 g Tris base and 80 g NaCl, ad 1 L H2O and adjust pH to 7.6
For 1x TBS-T mix 100 mL 10x TBS with 900 mL H2O and add 1 mL Tween-20
CD235a-PE Beckman Coulter A07792 use 5µl for staining
CD45-FITC Beckman Coulter 7782 use 5µl for staining
CD62E-PE Biolegend 336008 use 0.8µg for staining
CD62P-PE Biolegend 304905 use 0.1µg for staining
CD81 antibody Biolegend 349501 1:2000 in 5%BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting
CD9 antibody Immunotools 21270091 1:1000 in 5%BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting
Chemiluminescence imager ImageQuant LAS-4000 Fujitsu Life Sciences
DC protein assay kit II Bio-Rad 5000112
ECL detection reagent GE Healthcare RPN2232
EDTA vacutainers for blood collection Sarstedt 01.1605.001
FACSCanto II BD Biosciences
fetal calf serum (FCS) Invitrogen 10091148 heat-inactivated (30 min, 56°C)
filter 0.22µm Sarstedt 83.1826.001
HRP-coupled anti-mouse secondary antibody santa cruz sc-2005 use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T
HRP-coupled anti-rabbit secondary antibody santa cruz sc-2004 use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T
4x Laemmli loading buffer, Roti-Load 1 Roth K929.1
microfuge SIGMA 1-15K Sigma Laborzentrifugen
milk powder (Blotting-Grade Blocker, nonfat dry milk) BioRad 170-6404
multifuge 3 L-R Heraeus
NanoSight LM10 NanoSight Ltd.
PBS, w/o Ca and Mg Pan biotech P04-36500
perfusor syringe 50 mL Braun 8728844F
Ponceau-S staining solution PanReac AppliChem A2935,0500
rotor Sw32.1 Ti for ultracentrifugation (6x 17 mL) Beckman Coulter
rotor TLA-120.2 for ultracentrifugation (10x 1.5 mL) Beckman Coulter
tubes for flow cytometry (5 mL, round-bottom) BD Biosciences 352054
tubes for ultracentrifugation (15 mL) Beckman Coulter 344061
tubes for ultracentrifugation (11* 34 mm) Beckman Coulter 343778
Tubulin antibody Millipore 05-829 1:5000 in 5%BSA in TBST
ultracentrifuge Optima L-80 XP Beckman Coulter
ultracentrifuge TL-100 Beckman Coulter
valve filter Seraplas V15 Sarstedt 53,428
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Referências

  1. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
  2. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, (2015).
  3. Guescini, M., Genedani, S., Stocchi, V., Agnati, L. F. Astrocytes and Glioblastoma cells release exosomes carrying mtDNA. J Neural Transm (Vienna). 117 (1), 1-4 (2010).
  4. Balaj, L., et al. Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences. Nat Commun. 2, 180 (2011).
  5. Lee, T. H., et al. Oncogenic ras-driven cancer cell vesiculation leads to emission of double-stranded DNA capable of interacting with target cells. Biochem Biophys Res Commun. 451 (2), 295-301 (2014).
  6. Chi, K. R. The tumour trail left in blood. Nature. 532 (7598), 269-271 (2016).
  7. Pisitkun, T., Shen, R. -. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (36), 13368-13373 (2004).
  8. Harrington, M. G., et al. The morphology and biochemistry of nanostructures provide evidence for synthesis and signaling functions in human cerebrospinal fluid. Cerebrospinal Fluid Res. 6, 10 (2009).
  9. Admyre, C., et al. Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk. J Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).
  10. Caby, M. -. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int Immunol. 17 (7), 879-887 (2005).
  11. Nieuwland, R., et al. Cellular origin and procoagulant properties of microparticles in meningococcal sepsis. Blood. 95 (3), 930-935 (2000).
  12. Mfonkeu, J. B. P., et al. Elevated Cell-Specific Microparticles Are a Biological Marker for Cerebral Dysfunctions in Human Severe Malaria. PLoS One. 5 (10), e13415 (2010).
  13. Parker, B., et al. Suppression of inflammation reduces endothelial microparticles in active systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis. 73 (6), 1144-1150 (2014).
  14. Nozaki, T., et al. Prognostic value of endothelial microparticles in patients with heart failure. Eur J Heart Fail. 12 (11), 1223-1228 (2010).
  15. Galindo-Hernandez, O., et al. Elevated concentration of microvesicles isolated from peripheral blood in breast cancer patients. Arch Med Res. 44 (3), 208-214 (2013).
  16. Menck, K., et al. Tumor-derived microvesicles mediate human breast cancer invasion through differentially glycosylated EMMPRIN. J Mol Cell Biol. 7 (2), 143-153 (2015).
  17. Moon, P. -. G., et al. Identification of Developmental Endothelial Locus-1 on Circulating Extracellular Vesicles as a Novel Biomarker for Early Breast Cancer Detection. Clin Cancer Res. 22 (7), 1757-1766 (2016).
  18. Melo, S. A., et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).
  19. Kahlert, C., et al. Identification of Double-stranded Genomic DNA Spanning All Chromosomes with Mutated KRAS and p53 DNA in the Serum Exosomes of Patients with Pancreatic Cancer. J Biol Chem. 289 (7), 3869-3875 (2014).
  20. Shao, H., et al. Protein typing of circulating microvesicles allows real-time monitoring of glioblastoma therapy. Nat Med. 18 (12), 1835-1840 (2012).
  21. Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes. J Vis Exp. (59), (2012).
  22. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  23. Gustafson, C. M., Shepherd, A. J., Miller, V. M., Jayachandran, M. Age- and sex-specific differences in blood-borne microvesicles from apparently healthy humans. Biol Sex Differ. 6, (2015).
  24. Shelke, G. V., Lässer, C., Gho, Y. S., Lötvall, J. Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
  25. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (8), E968-E977 (2016).
  26. Dignat-George, F., Boulanger, C. M. The Many Faces of Endothelial Microparticles. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (1), 27-33 (2011).
  27. Esser, M. T., et al. Differential Incorporation of CD45, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), and Major Histocompatibility Complex Class I and II Molecules into Human Immunodeficiency Virus Type 1 Virions and Microvesicles: Implications for Viral Pathogenesis and Immune Regulation. J Virol. 75 (13), 6173-6182 (2001).
  28. Canellini, G., et al. Red blood cell microparticles and blood group antigens: an analysis by flow cytometry. Blood Transfus. 10 (2), s39-s45 (2012).
  29. Scholz, T., Temmler, U., Krause, S., Heptinstall, S., Lösche, W. Transfer of tissue factor from platelets to monocytes: role of platelet-derived microvesicles and CD62P. Thromb Haemost. 88 (6), 1033-1038 (2002).
  30. Berckmans, R. J., et al. Cell-derived microparticles circulate in healthy humans and support low grade thrombin generation. Thromb Haemost. 85 (4), 639-646 (2001).
  31. Rupp, A. -. K., et al. Loss of EpCAM expression in breast cancer derived serum exosomes: role of proteolytic cleavage. Gynecol Oncol. 122 (2), 437-446 (2011).
  32. Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).

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Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood. J. Vis. Exp. (119), e55057, doi:10.3791/55057 (2017).
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