Summary

Saptamak için deneysel protokol<em> Siyanobakteri</em> Bir Antikor Mikroarray Chip ile Sıvı ve Katı Örneklerinde

Published: February 07, 2017
doi:

Summary

The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.

Abstract

Küresel ısınma ve ötrofikasyon bazı sucul ekosistemlerin hızlı ve kitlesel siyanobakteri büyümesini tetikleyecek kadar gerçek biyoreaktörler davranırlar yapmak; Bu, ilgili sağlık ve ekonomik sonuçları vardır. Birçok Siyanobakteri suşları toksin üreticileri, ve sadece birkaç hücre çevreye onarılamaz zarar ikna etmek için gereklidir. Bu nedenle, su vücut yetkililer ve idareleri önleyici veya iyileştirici kararları desteklemek için güvenilir veri sağlama, hızlı ve verimli erken uyarı sistemleri gerektirir. Bu el yazması taksonomik çözünürlük (CYANOCHIP) ile 17 antikorları (Abs) ile bir antikor mikroarray çip kullanılarak toksin üreten Siyanobakteri suşları alan içinde tespiti için deneysel bir protokol bildirir. Burada, 17 siyanobakteriyel soyların aynı anda izlenmesi için çoklu bir flüoresan sandviç mikrodizi immüno (FSMI) sık sık tatlı su ekosistemlerinin açan bulunan, bazıları toksin üretici tarif edilmektedir. Çok olan bir mikrotertipple CYANOCHIP bölgesinin (24 saate kadar) benzer çoğaltır eş zamanlı numune benzer sayıda test etmek için, tek bir mikroskop lamı üzerine basılmıştır. Sıvı numuneleri antikorların (antikorlar) ile doğrudan inkübasyon yoluyla ya da 1 ila 3 mikron filtre içinden süzme ile hücre konsantrasyonu da sonra test edilebilir. Bu tortuların ve zemin taş gibi katı örnekleri, önce homojen hale getirilir ve bir kuluçka tampon maddesi içinde bir elde tutulan ultrasonikatör ile dağıtılır. Kaba malzeme çıkarmak göre – (20 uM 5) ve süzüntü Abs ile inkübe edilir Daha sonra filtrelenir. Immün reaksiyonlar 17 floresan etiketli antikorların bir karışımı ile bir son inkübasyon ile açığa çıkar ve taşınabilir floresan dedektör tarafından okunur. Tüm süreç en iyi şekilde inkübe iki 1 -H süreleri içinde elde edilen, yaklaşık 3 saat sürer. Çıktı parlak noktalar Siyanobakteri belirteçlerin olumlu algılama karşılık bir resim vardır.

Introduction

algılama ve karmaşık doğal mikrobiyal topluluklar mikroorganizmaların izlenmesi biyomedikal, çevre ekoloji ve Astrobiyoloji dahil olmak üzere birçok alanda, son derece önemlidir. Taze su içinde hücre çoğalması (aşırı çoğalması) oluşturmak için yetenekleri açısından iyi bilinen prokaryotik mikroorganizma Siyanobakteriler bulunmaktadır. Bunlar her yerde vardır, ve birçok türün insan sağlığı için potansiyel bir risk değil, aynı zamanda bir ekolojik etkisi sadece lider, toksinler üretebiliriz. Bu bağlamda, siyanobakteriler ve / veya toprak ve su içinde toksinlerin erken teşhisi için hızlı ve hassas bir yöntem geliştirmek gereklidir. Su yöneticileri uygun su yönetim programlarının uygulanmasında, dolayısıyla karar verme onlara yardım ve bu amaçla, bir multipleks floresan sandviç mikrodizi immunoassay (FSMI) bir araç olarak geliştirilmiştir.

yöntemler çeşitli bir yelpazede algılamak ve mavi tanımlamak için geliştirilmiştirOptik mikroskopi, moleküler biyoloji, ve immünolojik teknikler de dahil olmak üzere toprak ve su içinde obacterial hücreleri ve cyanotoxins. Bu yöntemler sağladıkları bilgiler büyük ölçüde değişebilir. Mikroskopik teknikler, hücre morfolojisi ve phycocyanin olarak siyanobakteri pigmentler arasında in vivo olarak floresans algılama ya da 1 klorofil dayanmaktadır. Onlar türü ve bir numunede mevcut Siyanobakterinin sayısı hakkında bilgi gerçek zamanlı ve sık izlenmesi için hızlı ve ucuz yöntemler olmasına rağmen, onlar potansiyel toksisitesi ile ilgili bilgi vermemektedir. Buna ek olarak, genellikle yakın türler 2 ayırt etmek zor olduğu göz önünde, uzmanlık belirli bir düzeyde gerekir. Bu sınırlamaları aşmak için, ışık mikroskobu, biyolojik ve biyokimyasal tarama deneyleri ve cyanotoxins tanımlanması ve ölçümü için fizikokimyasal yöntemlerle hem eşlik etmelidir.

<pSınıf = "jove_content"> enzim bağlı immünosorbent deneyleri (ELISA), protein fosfat inhibisyonu tahlilleri (PPIA), ve farelerde nöro-kimyasal testler cyanotoxins saptanması için biyokimyasal tarama deneyleri örnekleridir. İlk iki hızlı ve duyarlı bir metodolojileri iken kullanılarak ELISA ve PPIA testleri toksinler üç tip ile sınırlı olduğunda, yanlış pozitif tarif edilmiştir. Fare biyoassay gerekli düşük duyarlılık ve hassasiyet, ve özel lisanslama ve eğitim ile niteliksel bir tekniktir. Buna ek olarak, bir numunede mevcut olan toksinlerin türü hakkında bilgi vermemektedir. Cyanotoxins tanımlanır ve bu, yüksek performanslı sıvı kromatografisi gibi analitik yöntemler (HPLC), sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi ile tayin edilebilir (LC-MS), gaz kromatografisi (GC), gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi (GC-MS), veya matris destekli lazer çıkarma / iyonlaşma uçuş süresi (MALDI-TOF). referans standartları, gerek hangi Ancak, bu mümkündürKarmaşık numuneler bireysel toksin konsantrasyonlarını belirlemek için baskı, 3, 4 mevcuttur. Ayrıca, bu metodlar zaman alıcıdır; pahalı ekipman, sarf malzemeleri ve numune hazırlık gerektirir; deneyimli ve uzman personel tarafından yapılmalıdır.

Moleküler tabanlı yöntemler genom veritabanlarında yayınlanan dizi bilgiler sayesinde, tespit belirlemek ve siyanobakteri ve bunlara karşılık gelen cyanotoxins ölçmek için yıllardır uygulanmış olan (örneğin, Biyoteknoloji Bilgi, NCBI Ulusal Merkezi). Bu yöntemler arasında, DNA amplifikasyonu için primerlerin setleri tasarım gerektirir ve farklı siyanobakteri türlerinin DNA dizileri önceki bilgiye dayanır, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) dayalı olanlardır. Gen tespiti, phycocyanin operon gibi, cins düzeyinde doğru tanımlama yol açarken, bazı türler veya suşları ile algılanmayan olanBu method. Bununla birlikte, bu mikrosistin operon ait olanlar gibi, toksin kodlayıcı genleri, üretici 5 kıt örneklerde toksinlerin belirlenmesini kolaylaştırmaktadır. Yine de, PCR ile toksin işaretlerinin saptanması gerekli ortamında toksisite anlamına gelmez. Ayrıca, bir numunede bulunan siyanobakteri ve toksin üretici türlerinin dizi analiz için geliştirilmiş primerler kümesi hala eksik ve ileri çalışmalar bilinmeyen türler tanımlamak için yapılmalıdır. Diğer moleküler teknikler in situ hibridizasyon (FISH) ve DNA mikrodizileri floresan olarak, PCR-olmayan dayanmaktadır.

son yirmi yılda, mikrotertip teknolojisi, özellikle çevresel izleme, uygulama birçok alanda önem kazanmıştır. DNA mikroarray'ler türler ve analit 4 ayrımı, 6, 7 izin </sup>, 8, 9, 10, fakat çok zahmetli ve zaman alan bir çok adım (örneğin, mikro-dizi performansı, DNA izolasyonu, PCR amplifikasyonu ve hibridizasyon) işlerde olarak kabul edilir. Bu nedenle, bu tür bir sandviç ve rekabetçi immünolojik microarrays gibi antikorlar, göre daha az zaman alan deneyler, çoklu ortam analitler 11, 12, 13 tespit edilmesi için gerekli bir güvenilir ve yüksek verimli bir yöntem olmuştur. Antikorların yeteneği özel hedef bileşikleri tanıyan ve hemen hemen her maddeye karşı antikorların üretilmesi olasılığı ile birlikte, analit ve proteinlerin küçük miktarlarda tespit etmek için, antikoru mikrodizilerinde Çevre amaçlar için güçlü bir yöntem tercih. Buna ek olarak, birden fazla sağlama yeteneği olarak analizIngle deneyi, ppm ppb'ye kadar algılama sınırları ile bu yöntem 14 ana avantajlarından biridir.

Antikor-biyosensörler çevresel izleme 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 patojen ve zehirli geniş saptanması için, hassas ve hızlı bir araçlar olduğu kanıtlanmıştır. DNA yöntemleri çeşitli adımlar içerir birlikte, antikor bazlı mikrodizileri, yalnızca, uygun bir tampon çözelti kısa bir parçalama adımında dayanan küçük bir örnek hazırlık gerektirir. Delehanty ve Ligler 15 4 ppb An bir protein konsantrasyonu tespit edebilen bir antikor sandviç bağışıklık tahlili göre protein ve kompleks karışımlar bakteriyel analitlerin eşanlı deteksiyonunu raporD 10 4 cfu / hücrelerin ml. Szkola ve ark. 21 biyolojik savaş kullanılan olabilir proteotoxins ve küçük toksin, bileşiklerin birinin eş zamanlı saptanması için ucuz ve güvenilir bir çoklu mikrodizisi geliştirdik. Onlar az 20 dakika içinde 3 ppb, algılama limitli, risin toksin konsantrasyonları tespit edildi. Son zamanlarda, CYANOCHIP, zehirli ve toksik olmayan siyanobakteriler saptanması için bir antikor mikroarray bazlı biyosensör, 22 tarif edilmiştir. Bu mikrodizi çoğunlukla mikroskobik tespit etmek zordur sucul ortamlarda, potansiyel Siyanobakteri sahası belirlenmesi için izin verir. Hatta tür seviyesinde, çok katlı algılama ve siyanobakteri tanımlanması için düşük maliyetli bir araç haline Bu biyosensör dönüm çok türün 10 3 hücreleri, – mikrodizisinin tespit limiti 10 2 'dir. Bütün bu özellikler Antibo haledy mikrodizi tekniği ve bu çalışmada sunulan özel yöntem daha hızlı ve daha basit bir yöntem, söz konusu tekniklere göre.

Bu çalışma, toprak ve su örneklerinde Siyanobakterinin varlığını tespit etmek bir antikor mikroarray tabanlı biyosensör kullanmak deney iki örneklerini sunar. Çok küçük örnek hacimleri ve çok temel örnek hazırlama gerektiren bir sandviç immunoassay biçimine dayanan basit ve güvenilir bir yöntemdir. yöntem, kısa bir süre gerektirir ve kolay bir alanda gerçekleştirilebilir.

Protocol

İmünoj hazırlanması 1. Tablo 1 'de tarif edilen koşullar altında, karşılık gelen kültür ortamı her bir siyanobakteri suşu büyütün. NOT: Her siyanobakteri suşu için büyüme ortamı ve kültür koşulları, Tablo 1 'de listelenmiştir. Tüm Siyanobakteri suşları, K17 hariç, Autonoma Üniversitesi (Madrid, İspanya) Antonio Quesada adlı gruba aittir. Planktothrix rubescens konusu antikorun Vilasouto hazne (Kuzey İspanya) b…

Representative Results

Bu çalışma CYANOCHIP antikoru mikrodizisi kullanılarak en uygun, tatlı su, siyanobakteri türlerinin anında belirlenmesi (Tablo 1), çoklu bir bağışıklık testi anlatılmıştır. mikroarray mikroskop lamı üzerine basılmış bir 3 x 8 mikroarray biçimi olabilir. Her bir mikrodizi negatif kontroller olarak a, üçlü bir nokta desen baskılı 17 antikorlarının grubu, karşılık gelen ön-immün antikorları ve BSA oluşur. Mikro-diziler, aynı zamanda kol…

Discussion

Burada, CYANOCHIP, siyanobakteri cinslerin çeşitli saptanması ve tanımlanması için bir 17-antikor mikrodizisi kullanılarak çoklu bir flüoresan sandviç immüno 22 tarif edilmiştir. Bu siyanobakteri, tatlı su ortamlarında bazıları olmanın toksin üreticileri en sık bentik ve planktonik cinsi temsil etmektedir. Son zamanlarda, flüoresan sandviç immüno biçimi çevre uygulamaları 26, 27, <sup class="xr…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz siyanobakteri suşları sağlamak için Universidad Autonoma de Madrid Dr. Antonio Quesada teşekkür ederim. Bu eser İspanyolca Ministerio de Economía y Competitividad ve Subdirección General de Proyectos de INVESTIGACION (MINECO) tarafından finanse edildi, hayır verir. AYA2011-24803 ve ESP2014-58494-R.

Materials

0.22 mm pore diameter filters Millipore GSWP04700 For preparation of immunogens
Eppendorf  5424R microcentrifuge Fisher Scientific For preparation of immunogens
Phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 (10X) Thermofisher Scientific 70011036 50 mM potassium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4
Ultrasonic processor UP50H Hielscher For preparation of immunogens
Complete Freund's adjuvant  Sigma-Aldrich F5881 Immunopotentiator
Incomplete Freud's adjuvant Sigma-Aldrich  F5506 For boost injections
Protein A antibody purification kit   Sigma-Aldrich PURE1A  For isolation of IgG
Centrifugal filter devices MWCO<100 KDa Millipore UFC510096-96K For isolation of IgG
Dialysis tubings, benzoylated Sigma-Aldrich D7884-10FT For isolation of IgG
Illustra Microspin G-50 columns  GE-HealthCare GE27-5330-02 For isolation of IgG
Bradford reagent Sigma-Aldrich B6916-500 mL To quantify the antibody concentration
MicroBCA protein assay kit  Thermo Scientific 23235 To quantify the antibody concentration
Protein arraying buffer 2X Whatman (Sigma Aldrich)  S00537 Printing buffer; 30-40% glycerol in 1X PBS with 0.01% Tween 20
Tween 20  Sigma-Aldrich  P9416 Non-ionic detergent
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich  A9418 Control  for printing; blocking reagent
384-wells microplate Genetix X6004 For antibody printing
Robot arrayer for multiple slides MicroGrid II TAS arrayer from Digilab For antibody printing
Epoxy substrate glass slides Arrayit corporation VEPO25C Solid support for antibody printing
Alexa Fluor-647 Succinimidyl-ester  Molecular probes A20006 Fluorochrome
DMSO  Sigma-Aldrich  D8418 Fluorochrome dissolvent
Heidolph Titramax vibrating platform shaker Fisher Scientific For antibody labeling 
Illustra Microspin G-50 columns  Healthcare 27-5330-01 For purification of labeled antibodies
Safe seal brown 0,5 ml tubes Sarstedt 72,704,001 For labeled antibodies storage 
Nanodrop 1000 spectrophotometer Thermo Scientific To quantify antibody concentration and labeling efficiency
3 µm pore size polycarbonate 47 mm diameter filter Millipore TMTP04700 To concentrate cells
1M Trizma hydrochloride solution pH 8 Sigma-Aldrich  T3038 For TBSTRR preparation; to block slides
Sodium chloride Sigma-Aldrich  S7653 For TBSTRR preparation
20 µm nylon filters  Millipore NY2004700 For environmental extract preparation
10-12 mm filter holders Millipore SX0001300 For environmental extract preparation
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich  P8340 For environmental extract storage
1M Trizma hydrochloride solution pH 9 Sigma-Aldrich  T2819 To block slides
Heidolph Duomax 1030 rocking platform shaker VWR To block slides; for incubation processes 
VWR Galaxy miniarray microcentrifuge VWR C1403-VWR To dry slides
Multi-Well microarray hybridization cassette Arrayit corporation AHC1X24 Cassette for 24 assays per slide
GenePix 4100A microarray scanner  Molecular Devices Scanner for fluorescence
GenePix Pro Software Molecular Devices Software for image analysis and quantification

Referências

  1. Simis, S. G. H., Peters, S. W. M., Gons, H. J. Remote sensing of the cyanobacterial pigment phycocianin in turbid inland water. Limnol. Oceanogr. 50 (1), 237-245 (2005).
  2. Zamyadi, A., McQuaid, N., Prevost, M., Dorner, S. Monitoring of potentially toxic cyanobacteria using an online multi-probe in drinking water sources. J. Environ. Monit. 14, 579-588 (2012).
  3. Msagati, T. A. M., Siame, B. A., Shushu, D. D. Evaluation of methods for the isolation, detection and quantification of cyanobacterial hepatotoxins. Aquat. Toxicol. 78 (4), 382-397 (2006).
  4. Weller, M. G. Immunoassays and biosensors for the detection of cyanobacterial toxins in water. Sensors. 13 (11), 15085-15112 (2013).
  5. Baker, J. A., Neilan, B. A., Entsch, B., McKay, D. B. Identification of cyanobacteria and their toxigenicity in environmental samples by rapid molecular analysis. Environ. Toxicol. 16 (6), 472-482 (2001).
  6. Li, H., Singh, A. K., McIntyre, L. M., Sherman, L. A. Differential gene expression in response to hydrogen peroxide and the putative PerR regulon of Synechocystis sp. Strain PCC 6803. J. Bacteriol. 186 (11), 3331-3345 (2004).
  7. Anderson, D. M., Cembella, A. D., Hallegraeff, G. M. Progress in understanding harmful algal blooms: paradigm shifts and new technologies for research, monitoring, and management. Ann. Rev. Mar. Sci. 4, 143-176 (2012).
  8. Dittami, S. M., Pazos, Y., Laspra, M., Medlin, L. K. Microarray testing for the presence of toxic algae monitoring programme in Galicia (NW Spain). Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 20, 6778-6793 (2013).
  9. Kegel, J. U., Del Amo, ., Medlin, Y., K, L. Introduction to Project MIDTAL: its methods and samples from Arcachon Bay, France. Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 20 (10), 6690-6704 (2013).
  10. Marcheggiani, S., et al. Detection of emerging and re-emerging pathogens in surface waters close to an urban area. Int. J. Environ. Res. Public Health. 12 (5), 5505-5527 (2015).
  11. Fernández-Calvo, P., Näke, C., Rivas, L. A., García-Villadangos, M., Gómez-Elvira, J., Parro, V. A multi-array competitive immunoassay for the detection of broad-range molecular size organic compounds relevant for astrobiology. Planet. Space Sci. 54 (815), 1612-1621 (2006).
  12. Parro, V. . Antibody microarrays for environmental monitoring. Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. , 2699-2710 (2010).
  13. Fan, Z., Keum, Y. S., Li, Q. X., Shelver, W. L., Guo, L. H. Sensitive immunoassay detection of multiple environmental chemicals on protein microarrays using DNA/dye conjugate as a fluorescent label. J. Environ. Monit. 14 (5), 1345-1352 (2012).
  14. Rivas, L. A., García-Villadangos, M., Moreno-Paz, M., Patricia Cruz-Gil, P., Gómez-Elvira, J., Parro, V. A 200-Antibody microarray biochip for environmental monitoring: Searching for universal microbial biomarkers through immunoprofiling. Anal. Chem. 80 (21), 7970-7979 (2008).
  15. Delehanty, J. B., Ligler, F. S. A microarray immunoassay for simultaneous detection of proteins and bacteria. Anal. Chem. 74 (21), 5681-5687 (2002).
  16. Ligler, F. S., Taitt, C. R., Shriver-Lake, L. C., Sapsford, K. E., Shubin, Y., Golden, J. P. Array biosensor for detection of toxins. Anal. Bioanal. Chem. 377 (3), 469-477 (2003).
  17. Rucker, V. C., Havenstrite, K. L., Herr, A. E. Antibody microarrays for native toxin detection. Anal. Biochem. 339 (2), 262-270 (2005).
  18. Kang, J., Kim, S., Kwon, Y. Antibody-based biosensors for environmental monitoring. Toxicol. Environ. Health. Sci. 1 (3), 145-150 (2009).
  19. Herranz, S., Marazuela, M. D., Moreno-Bondi, M. C. Automated portable array biosensor for multisample microcystin analysis in freshwater samples. Biosens. Bioelectron. 33 (1), 50-55 (2012).
  20. Shlyapnikov, Y., et al. Rapid simultaneous ultrasensitive immunodetection of five bacterial toxins. Anal. Chem. 84 (13), 5596-5603 (2012).
  21. Szkola, A., et al. Rapid and simultaneous detection of ricin, staphylococcal enterotoxin B and saxitoxin by chemiluminescence-based microarray immunoassay. Analyst. 139, 5885-5892 (2014).
  22. Blanco, Y., Quesada, A., Gallardo-Carreño, I., Jacobo Aguirre, ., Parro, J., V, CYANOCHIP: An antibody microarray for high-taxonomical-resolution cyanobacterial monitoring. Environ. Sci. Technol. 49 (3), 1611-1620 (2015).
  23. Bradford, M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Chem. 72, 248-254 (1976).
  24. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
  25. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using Bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  26. Rivas, L. A., Aguirre, J., Blanco, Y., González-Toril, E., Parro, V. Graph-based deconvolution analysis of multiplex sandwich microarray immunoassays: applications for environmental monitoring. Environ. Microbiol. 13 (6), 1421-1432 (2011).
  27. Blanco, Y., et al. Deciphering the prokaryotic community and metabolisms in south african deep-mine biofilms through antibody microarrays and graph theory. PloS One. 9 (2), e114180 (2014).
  28. Gas, F., Baus, B., Queré, J., Chapelle, A., Dreanno, C. Rapid detection and quantification of the marine toxic algae, Alexandrium minutum, using a super-paramagnetic immunochromatographic strip test. Talanta. 147, 581-589 (2016).
  29. Parro, V., et al. SOLID3: a multiplex antibody microarray-based optical sensor instrument for in situ life detection in planetary exploration. Astrobiology. 11, 15-28 (2011).
  30. McKay, C. P., et al. The Icebreaker Life Mission to Mars: a search for biomolecular evidence for life. Astrobiology. 13, 334-353 (2013).

Play Video

Citar este artigo
Blanco, Y., Moreno-Paz, M., Parro, V. Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip. J. Vis. Exp. (120), e54994, doi:10.3791/54994 (2017).

View Video