Strukturbestämning via röntgenkristallografi har gjort fundamentala bidrag till alla områden av modern biologi, tillhandahålla ett atom vy av makromolekylerna som stöder livet och hur de samverkar med varandra i en mängd olika sammanhang; tillåter oss att förstå de mekanismer som orsakar sjukdom och ger möjligheter att rationellt utforma läkemedel mot sjukdomen. Kristallografi har länge varit den dominerande experimentell teknik för att bestämma makromolekylära struktur, och står för närvarande för 89,3% av den strukturella databasen (www.rcsb.org). Denna teknik har många fördelar, inklusive möjligheten till mycket hög upplösning, förmågan att visualisera makromolekyler med ett brett intervall av storlekar, relativt lätt för datainsamling, och möjlighet att visualisera hur makromolekylen interagerar med lösningsmedel samt ligander.

Trots ett stort antal tekniska förbättringar i rekombinant proteinuttryck ^1,2, purförgasning ³ och molekylärbiologi används för att generera dessa system ^4, den enskilt största hindret i den kristallografiska processen fortfarande förmågan att växa diffraktion kvalitet kristaller. Detta har varit särskilt sant för proteiner som innehåller stora coiled-coil-domäner. Det har uppskattats att så mycket som 5% av alla aminosyror finns inom lindade-spolar ^5,6, vilket gör detta ett mycket vanligt strukturellt drag ^7, men dessa proteiner är ofta svårare att rena och kristallisera än globulära proteiner ^8-10 . Detta förvärras ytterligare av det faktum att coiled-coil-domäner finns ofta inom ramen för ett större protein, därför korrekt förutsäga gränserna för dessa domäner är avgörande för att undvika införandet av ostrukturerad eller flexibel sekvens som ofta är skadlig för kristallisation.

Här presenterar vi en konceptuell ram som kombinerar webbaserad beräkningsanalyser med Experimental data från bänken, som hjälper användarna genom de inledande skedena av den kristallografiska processen inklusive: Hur man väljer proteinfragment (s) för strukturstudier, och hur man förbereder och karakterisera proteinprover före kristallisa försök. Vi fokuserar vår analys på två proteiner som innehåller stora ringlad-spiraldomäner, Shroom (SHRM) och Rho-kinas (Rock). Dessa proteiner valdes eftersom de båda innehåller coiled-coil-domäner och är kända för att bilda en biologiskt relevant komplex ^11-16. Shroom och Rho-kinas (Rock) förutsägs innehålla ~ 200 och 680 rester av coiled-coil respektive många delar som har präglats strukturellt ^17-20. Den metod som beskrivs här ger en strömlinjeformad arbetsflöde för att snabbt identifiera fragment av coiled-coil innehållande protein som kommer att vara mottaglig för kristallisation är emellertid den teknik som beskrivs kan lätt anpassas för de flesta protein eller proteinkomplex eller modifierad för att införliva hög genomströmning approaches som finns. Slutligen dessa metoder är i allmänhet billigt och kan utföras av användare på nästan alla erfarenheter nivåer.