Combinando Wet and Dry técnicas de laboratório para orientar a cristalização de grandes espiral enrolada contendo proteínas

determinação da estrutura através de cristalografia de raios-X fez contribuições fundamentais para todos os campos da biologia moderna; proporcionando uma visão atômica das macromoléculas que suportam a vida e como eles interagem uns com os outros em uma variedade de contextos; o que nos permite compreender os mecanismos que causam a doença e fornecendo oportunidades para racionalmente projetar medicamentos para tratar a doença. Cristalografia tem sido a técnica experimental dominante para a determinação da estrutura de macromoléculas, e atualmente responde por 89,3% da base de dados estrutural (www.rcsb.org). Esta técnica tem muitas vantagens, incluindo a possibilidade de muito alta resolução, a capacidade de visualizar macromoléculas com uma ampla gama de tamanhos, a recolha de dados relativamente fácil, e a oportunidade de visualizar como a macromolécula interage com solvente, bem como ligantes.

Apesar das inúmeras melhorias tecnológicas na expressão da proteína recombinante ^1,2, purificação ^3, e biologia molecular utilizados para gerar estes sistemas ^4, o maior obstáculo no processo cristalográfica permanece a capacidade de crescer cristais de qualidade de difracção. Isto tem sido especialmente verdadeiro para as proteínas que contêm os domínios grandes em espiral enrolada. Estimou-se que, tanto quanto 5% de todos os aminoácidos são encontrados dentro de bobinas ^{enroladas-5,6,} tornando esta uma característica estrutural muito comum ^7, mas estas proteínas são muitas vezes mais difícil de purificar e cristalizar do que as proteínas globulares ^8-10 . Isto é ainda mais agravado pelo facto de que os domínios em espiral espiralada são encontrados frequentemente no contexto de uma proteína maior, portanto, prever correctamente as fronteiras destes domínios é crítico para evitar a inclusão de sequência não estruturado ou flexível que é muitas vezes prejudicial para a cristalização.

Aqui nós apresentamos uma estrutura conceitual combinando web-based computacional analisa com a Experimental Dados do banco, para ajudar a guiar os usuários através dos estágios iniciais do processo de cristalografia, incluindo: como selecionar fragmento (s) de proteína para estudos estruturais e como preparar e caracterizar amostras de proteínas antes de quaisquer tentativas de cristalização. Nós nos concentramos nossa análise em duas proteínas contendo domínios grandes em espiral enrolada, Shroom (SHRM) e Rho-quinase (Rock). Estas proteínas foram escolhidos uma vez que ambos contêm domínios em espiral espiralada e são conhecidas para formar um complexo biologicamente relevante ^11-16. Shroom e Rho-cinase (rocha) são previstos para conter ~ 200 e 680 resíduos de espiral enrolada, respectivamente, muitas porções da qual têm sido caracterizados estruturalmente ^17-20. O método descrito aqui fornece um fluxo de trabalho simplificado para identificar rapidamente contendo fragmentos de proteína de filamento helicoidal que serão tratáveis ​​através de cristalização, no entanto, as técnicas descritas podem ser facilmente adaptadas para a maioria de proteínas ou complexos de proteína ou modificada para incorporar high-throughput approaChes como disponíveis. Por último, estes métodos geralmente são baratos e podem ser realizadas pelos usuários em quase todos os níveis de experiência.