Summary

Cefoperazona tratados modelo de ratón clínicamente relevante<em> Clostridium difficile</em> R20291 Strain

Published: December 10, 2016
doi:

Summary

Este protocolo se describe el modelo de ratón cefoperazona de la infección por Clostridium difficile (CDI), utilizando una cepa clínicamente relevante y genéticamente manejable, R20291. Énfasis en el seguimiento clínico de la enfermedad, C. difficile enumeración bacteriana, la citotoxicidad de la toxina, y los cambios histopatológicos en todo CDI en un modelo de ratón se detalla en el protocolo.

Abstract

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and consequently poses an urgent threat to public health. Recurrence of a C. difficile infection (CDI) after successful treatment with antibiotics is high, occurring in 20-30% of patients, thus necessitating the discovery of novel therapeutics against this pathogen. Current animal models of CDI result in high mortality rates and thus do not approximate the chronic, insidious disease manifestations seen in humans with CDI. To evaluate therapeutics against C. difficile, a mouse model approximating human disease utilizing a clinically-relevant strain is needed. This protocol outlines the cefoperazone mouse model of CDI using a clinically-relevant and genetically-tractable strain, R20291. Techniques for clinical disease monitoring, C. difficile bacterial enumeration, toxin cytotoxicity, and histopathological changes throughout CDI in a mouse model are detailed in the protocol. Compared to other mouse models of CDI, this model is not uniformly lethal at the dose administered, allowing for the observation of a prolonged clinical course of infection concordant with the human disease. Therefore, this cefoperazone mouse model of CDI proves a valuable experimental platform to assess the effects of novel therapeutics on the amelioration of clinical disease and on the restoration of colonization resistance against C. difficile.

Introduction

Clostridium difficile es un anaerobio,, Bacillus formador de esporas gram-positiva que causa diarrea que amenaza la vida 1. Infección por C. difficile (CDI) se asocia con una mayor morbilidad y mortalidad humana y los resultados en más de $ 4.8 mil millones en costos de salud por año 1-4. En 2013, los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades clasifican C. difficile como un riesgo de resistencia a antibióticos urgente, lo que indica que presenta una amenaza inmediata para la salud pública 1. Actualmente, el tratamiento antibiótico con vancomicina y metronidazol se consideran el estándar de cuidado para CDI 5. Desafortunadamente, la recurrencia de CDI después del tratamiento exitoso con antibióticos es alta, se produce en 20 – 30% de los pacientes 2,5-7. Por lo tanto, el descubrimiento de nuevas terapias contra este patógeno entérico es necesario. Para evaluar la terapéutica frente a C. difficile, un modelo animal que se aproxima la enfermedad humana en corriente alternaSe necesita cepa linically relevantes.

Inicialmente, se establecieron los postulados de Koch para C. difficile en 1977, utilizando un modelo de hámster sirio clindamicina tratados con 8. Este modelo todavía se utiliza hoy en día para investigar los efectos de toxinas de C. difficile en la patogénesis 9,10. Sin embargo, el CDI en el modelo de hámster se traduce en altas tasas de mortalidad y no se aproxima a las manifestaciones de la enfermedad insidiosa crónicas que se pueden ver en los seres humanos con CDI 10,11. Sobre la base de la disponibilidad y accesibilidad de reactivo de plataformas murinas en investigación, un modelo de ratón de CDI es relevante.

En 2008, un modelo sólido ratón de CDI se estableció mediante el tratamiento de ratones con un cóctel de antibióticos en el agua potable (kanamicina, gentamicina, colistina, metronidazol y vancomicina) durante 3 días, seguido de una inyección intraperitoneal de clindamicina 12. Este ratones que son más susceptibles a la colitis CDI y severa. Dependering de la dosis de inóculo administrado, una amplia gama de signos clínicos y la letalidad se puede observar utilizando este modelo. Desde entonces, varios regímenes de antibióticos se han investigado que alteran la microbiota intestinal murino, disminuyendo la resistencia a la colonización hasta el punto en C. difficile puede colonizar el tracto gastrointestinal (revisado en Best et al. Y Lawley & Young) 13,14.

Más recientemente, un amplio espectro de cefalosporina, cefoperazona, dada en el agua de bebida durante 5 o 10 días reproducible hace ratones susceptibles a CDI 15. Puesto que la administración de cefalosporinas de tercera generación están asociados con un mayor riesgo de CDI en los seres humanos, el uso del modelo de cefoperazona refleja con mayor precisión la enfermedad 16 de origen natural. Cefoperazona tratados con ratones susceptibles a C. difficile han sido desafiados con las dos esporas de C. difficile y células vegetativas de una variedad de cepas que van de clínicarelevancia y la virulencia 17. A pesar de algunos de los estudios originales que utilizan C. difficile células vegetativas como la forma infecciosa, esporas de C. difficile se consideran el principal modo de transmisión 18.

En la última década, C. difficile R20291, a / BI / 027 NAP1, ha surgido, causando epidemias de CDI 19,20. Hemos tratado de determinar la evolución clínica de la enfermedad, cuando los ratones tratados con cefoperazona fueron desafiados con la cepa de C. difficile clínicamente relevante y genéticamente manejable, R20291. Este protocolo se detalla el curso clínico, incluyendo pérdida de peso, la colonización bacteriana, la citotoxicidad de la toxina, y cambios histopatológicos en el tracto gastrointestinal de los ratones desafiados con esporas de C. difficile R20291. En general, este modelo de ratón demuestra ser una plataforma experimental valioso para CDI aproximación de la enfermedad humana. Este modelo de ratón caracterizado por lo tanto se puede utilizar para evaluar los efectosde nuevas terapias en la mejora de la enfermedad clínica y en la restauración de la resistencia a la colonización contra C. difficile.

Protocol

Declaración de ética: El Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) en Carolina del Norte Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Estatal (NCSU) aprobó este estudio. El Cuidado de Animales NCSU y usar la directiva aplica las normas y directrices establecidas en la Ley de Ley y Extensión Investigación en Salud Animal Welfare de 1985. Las instalaciones de los animales de laboratorio en la NCSU adherirse a las directrices establecidas en la Guía para el Cuidado y Uso de Animale…

Representative Results

Durante un estudio representativo, 5 semanas de edad C57BL / 6 ratones WT fueron pretratados con cefoperazona en su agua potable (0,5 mg / ml) durante 5 días y se dejaron a 2 días a lavar con agua potable regular. Los ratones fueron retados con 10 5 esporas de C. difficile R20291 mediante sonda oral en el día 0 (Figura 1A). Los ratones se controlaron para la pérdida de peso y los signos clínicos (letargo, inapetencia, diarrea, y la postura encorv…

Discussion

This protocol characterizes the clinical course, including weight loss, bacterial colonization, toxin cytotoxicity, and histopathological changes in the gastrointestinal tract, of antibiotic-treated mice challenged with C. difficile R20291 spores. There are several critical steps within the protocol where attention to detail is essential. Accurate calculation of the C. difficile spore inoculum is critical. This calculation is based on the original C. difficile spore stock enumeration, which sho…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank Trevor Lawley at the Wellcome Trust Sanger Institute for C. difficile R20291 spores and James S. Guy at the North Carolina State University College of Veterinary Medicine for Vero cells, both utilized in this manuscript. Animal histopathology was performed in the LCCC Animal Histopathology Core Facility at the University of North Carolina at Chapel Hill, with special assistance from Traci Raley and Amanda Brown. The LCCC Animal Histopathology Core is supported in part by an NCI Center Core Support Grant (2P30CA016086-40) to the UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center. We would also like to thank Vincent Young, Anna Seekatz, Jhansi Leslie, and Cassie Schumacher for helpful discussions on the Vero cell cytotoxicity assay protocol. JAW is funded by the Ruth L. Kirschstein National Research Service Award Research Training grant T32OD011130 by NIH. CMT is funded by the career development award in metabolomics grant K01GM109236 by the NIGMS of the NIH.

Materials

#62 Perisept Sporidicial Disinfectant Cleaner  SSS Navigator 48027 This product will require dilution as recommended by the manufacturer
0.22 μm filter Fisherbrand 09-720-3 Alternative to filter plate for indivdiual samples tested in the Vero Cell Assay
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-056 Needs to be heated in water bath at 37C prior to use
0.4% Trypan Blue Gibco 15250-061
1% Peniciilin/Streptomycin Gibco 15070-063
10% heat inactivated FBS Gibco 16140-071 Needs to be heated in water bath at 37C prior to use
1ml plastic syringe  BD Medical Supplies 309628
1X PBS Gibco 10010-023
2 ml Micro Centrifuge Screw Cap Corning 430917
96 well cell culture flat bottom plate Costar Corning CL3595
96 well filter plate Millipore MSGVS2210
Adhesive Seal ThermoScientific AB-0558
Bacto Agar Becton Dickinson 214010 Part of TCCFA plates (see below)
Bacto Proteose Peptone Becton Dickinson 211684 Part of TCCFA plates (see below)
Cefoperazone MP Bioworks 199695
Cefoxitine Sigma C47856 Part of TCCFA plates (see below)
Clostridium difficile Antitoxin Kit Tech Labs T5000 Used as control for Vero Cell Assay
Clostridium difficile Toxin A List Biological Labs 152C Positive control for Vero Cell Assay
D-cycloserine Sigma C6880 Part of TCCFA plates (see below)
Distilled Water Gibco 15230
DMEM 1X Media Gibco 11965-092 Needs to be heated in water bath at 37C prior to use
Fructose Fisher L95500 Part of TCCFA plates (see below)
Hemocytometer Bright-Line, Sigma Z359629
KH2PO4 Fisher P285-500 Part of TCCFA plates (see below)
MgSO4 (anhydrous) Sigma M2643 Part of TCCFA plates (see below)
Millex-GS 0.22 μm filter Millex-GS SLGS033SS Filter for TCCFA plates 
Na2HPO4 Sigma S-0876 Part of TCCFA plates (see below)
NaCl Fisher S640-3 Part of TCCFA plates (see below)
Number 10 disposable scalpel blade Miltex, Inc 4-410
PCR Plates Fisherbrand 14230244
Plastic petri dish Kord-Valmark Brand 2900
Sterile plastic L-shaped cell spreader Fisherbrand 14-665-230
Syringe Stepper Dymax Corporation T15469
Taurocholate Sigma T4009 Part of TCCFA plates (see below)
Ultrapure distilled water Invitrogen 10977-015
C57BL/6J Mice The Jackson Laboratory 664 Mice should be 5-8 weeks of age
Olympus BX43F light microscope Olympus Life Science
DP27 camera Olympus Life Science
cellSens Dimension software  Olympus Life Science

Referências

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Citar este artigo
Winston, J. A., Thanissery, R., Montgomery, S. A., Theriot, C. M. Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291. J. Vis. Exp. (118), e54850, doi:10.3791/54850 (2016).

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