Optogenetic Random Mutagenese Bruke Histone-miniSOG i<em> C. elegans</em
Summary
Genetisk kodet histon-miniSOG induserer genom-wide arve mutasjoner i et blått lys avhengig måte. Dette mutagenese metoden er enkel, rask, fri for giftige kjemikalier, og godt egnet for videre genetisk screening og transgenet integrasjon.
Abstract
Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.
Introduction
Termin genetiske skjermer har blitt mye brukt til å generere genetiske mutanter forstyrre ulike biologiske prosesser i modellorganismer som Caenorhabditis elegans (C. elegans) 1. Analyser av slike mutanter føre til oppdagelse av funksjonelt viktige gener og deres signalveier 1,2. Tradisjonelt mutagenese i C. elegans oppnås ved bruk av mutagene kjemikalier, stråling, eller transposoner 2. Kjemikalier som etylmetansulfonat (EMS) og N-etyl-N -nitrosourea (ENU) er giftige for mennesker; gamma-ray eller ultrafiolett (UV) stråling mutagenese krever spesialutstyr; og transposon-aktive stammer som Mutator stammer 3, kan føre til unødvendige mutasjoner under vedlikehold. Vi har utviklet en enkel tilnærming til å indusere arve mutasjoner ved hjelp av en genetisk kodet fotosensibiliserende 4.
Reaktive oksygenforbindelser (ROS) kan skade DNA fem.Mini Singlet Oxygen generator (miniSOG) er et grønt fluorescerende protein på 106 aminosyrer som ble konstruert fra LOV (lys, oksygen og spenning) domene av Arabidopsis phototropin 2 6. Ved eksponering for blått lys (~ 450 nm), miniSOG genererer ROS inkludert singlet oksygen med fl avin mononukleotid som en kofaktor 6-8, som er til stede i alle celler. Vi har konstruert en His-mSOG fusjonsproteinet ved å merke miniSOG til den C-terminale ende av histon-72, en C. elegans variant av Histone 3. Vi ga en løssalgs transgen 9 til å uttrykke Hans-mSOG i germline av C. elegans. Under normale dyrkningsforhold i mørke, Hans-mSOG transgene ormer har normal kullstørrelse og levetid fire. Ved eksponering for blå LED lys, Hans-mSOG ormer produserer arve mutasjoner blant deres avkom 4. Spekteret av induserte mutasjoner omfatter nucleotide endringer, for eksempel G: C til T: A og G: C til C: G og små chromosomeg slettinger fire. Dette mutagenese prosedyren er enkel å utføre, og krever minimalt med lab sikkerhet oppsett. Her beskriver vi LED-belysning oppsett og prosedyrer for optogenetic mutagenese.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en detaljert fremgangsmåte for optogenetic mutagenese bruker Hans-mSOG uttrykt i germline og gi et eksempel på en liten skala frem genetisk skjermen. Sammenlignet med standard kjemisk mutagenese, har dette optogenetic mutagenese fremgangsmåte flere fordeler. For det første er det ikke giftig, og dermed holde lab personell unna giftige kjemiske mutagener som EMS, ENU og trimethylpsoralen med ultrafiolett lys (TMP / UV). For det andre kan den eksperimentelle prosedyren ifølge mutagenese benyttes for …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work is supported by HHMI. We thank our lab members for their help with testing the protocol and revising the manuscript.
Materials
| Ultra High Power LED light source | Prizmatix | UHP-mic-LED-460 | 460 ± 5 nm |
| LED controller | Prizmatix | UHPLCC-01 | |
| Digital function generator/amplifier | PASCO | PI-9587C | PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127. |
| BNC cable male/male | THORLABS | CA3136 | |
| USB-TTL interface | Prizmatix | Optional | |
| Photometer | THORLABS | PM50 and Model D10MM | |
| Filter paper | Whatman | 1001-110 | |
| Copper chloride dihydrate (CuCl2∙2H2O) | Sigma | C6641 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ95 | |
| NGM plate | Dissolve 5g NaCl, 2.5g Peptone, 20g Agar, 10 µg/ml cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH6.0). | ||
| Lysis solution | 10 mM Tris(pH8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X100, 2.5 mM MgCl2, 100 µg/ml Proteinase K |
Referências
- Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat Rev Genet. 3 (5), 356-369 (2002).
- Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
- Collins, J., Saari, B., Anderson, P. Activation of a transposable element in the germ line but not the soma of Caenorhabditis elegans. Nature. 328 (6132), 726-728 (1987).
- Noma, K., Jin, Y. Optogenetic mutagenesis in Caenorhabditis elegans. Nat Commun. 6, 8868 (2015).
- Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. FASEB J. 17 (10), 1195-1214 (2003).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biol. 9 (4), 1001041 (2011).
- Ruiz-Gonzalez, R., et al. Singlet oxygen generation by the genetically encoded tag miniSOG. J Am Chem Soc. 135 (26), 9564-9567 (2013).
- Pimenta, F. M., Jensen, R. L., Breitenbach, T., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. Oxygen-dependent photochemistry and photophysics of “miniSOG,” a protein-encased flavin. Photochem Photobiol. 89 (5), 1116-1126 (2013).
- Frokjaer-Jensen, C., et al. Random and targeted transgene insertion in Caenorhabditis elegans using a modified Mos1 transposon. Nat Methods. 11 (5), 529-534 (2014).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genética. 77 (1), 71-94 (1974).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), (2011).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), (2008).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
- Fay, D., Bender, A. Genetic mapping and manipulation: chapter 4–SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , 1-7 (2006).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Westberg, M., Holmegaard, L., Pimenta, F. M., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. Rational design of an efficient, genetically encodable, protein-encased singlet oxygen photosensitizer. J Am Chem Soc. 137 (4), 1632-1642 (2015).
- Xu, S., Chisholm, A. D. Highly efficient optogenetic cell ablation in C. elegans using membrane-targeted miniSOG. Sci Rep. 6, 21271 (2016).
- Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. J Vis Exp. (82), (2013).
- Lin, J. Y., et al. Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI). Neuron. 79 (2), 241-253 (2013).
- Minevich, G., Park, D. S., Blankenberg, D., Poole, R. J., Hobert, O. CloudMap: A Cloud-Based Pipeline for Analysis of Mutant Genome Sequences. Genética. 192 (>4), 1249-1269 (2012).
- Qi, Y., Xu, S. MiniSOG-mediated Photoablation in Caenorhabdtis elegans. Bio-protocol. 3 (1), 316 (2013).
- Qi, Y. B., Garren, E. J., Shu, X., Tsien, R. Y., Jin, Y. Photo-inducible cell ablation in Caenorhabditis elegans using the genetically encoded singlet oxygen generating protein miniSOG. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (19), 7499-7504 (2012).
- Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
