Генетически-кодируемый гистона-miniSOG индуцирует генома наследуемые мутации в голубой светло-зависимым образом. Этот метод мутагенеза является простым, быстрым, свободным от токсичных химических веществ, а также хорошо подходит для прямого генетического скрининга и интеграции трансгена.
Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.
Форвард генетический скрининг широко используются для создания генетических мутантов разрушающие различные биологические процессы в модельных организмах , таких как Caenorhabditis Элеганс (C. Элеганс) 1. Анализ таких мутантов приводят к открытию функционально важных генов и их сигнальных путей 1,2. Традиционно мутагенеза в C. Элеганс достигается за счет использования мутагенных химических веществ, радиации или транспозонов 2. Химические вещества , такие как этиловый эфир метансульфоната (EMS) и N – этил – N -nitrosourea (ENU) являются токсичными для человека; гамма-лучей или ультрафиолетового (УФ) излучения мутагенеза требует специального оборудования; и транспозонов-активные штаммы, такие как мутаторов штаммов 3, может вызвать ненужные мутации во время технического обслуживания. Мы разработали простой подход , чтобы вызвать наследуемые мутации с использованием генетически закодированного фотосенсибилизатора 4.
Активных форм кислорода (ROS) может привести к повреждению ДНК 5.Мини – Синглетно генератор кислорода (miniSOG) представляет собой зеленый флуоресцентный белок из 106 аминокислот , который был сконструированных из LOV (света, кислорода, и напряжение) области Arabidopsis phototropin 2 6. Под воздействием синего света (~ 450 нм), miniSOG генерирует РОС в том числе синглетный кислород с фл Авин мононуклеотид как кофактор 6-8, который присутствует во всех клетках. Мы сконструировали гибридный белок His-mSOG помечая miniSOG на С-конце гистона-72, в C. Элеганс вариант гистона 3. Мы создали одностраничный копию трансгена 9 , чтобы выразить Его-mSOG в зародышевую C. Элеганс. При нормальных условиях культивирования в темноте, трансгенные черви Его-mSOG имеют нормальный размер выводка и срок службы 4. При воздействии синей подсветкой, черви His-mSOG производят наследуемые мутации среди их потомства 4. Спектр индуцированных мутаций включает в себя нуклеотидные изменения, такие как G: C Т: А и G: C к C: G и небольшой chromosoя делеции 4. Эта процедура мутагенеза проста для выполнения, и требует минимальной настройки безопасности лаборатории. Здесь мы опишем установку светодиодной подсветки и процедуры для оптогенетика мутагенеза.
Здесь мы опишем подробно процедура оптогенетика мутагенеза с использованием His-mSOG выражается в зародышевой линии и представляют собой пример малого масштаба вперед генетического экрана. По сравнению со стандартным химического мутагенеза, этот оптогенетика метод мутагенеза имеет не?…
The authors have nothing to disclose.
The work is supported by HHMI. We thank our lab members for their help with testing the protocol and revising the manuscript.
Ultra High Power LED light source | Prizmatix | UHP-mic-LED-460 | 460 ± 5 nm |
LED controller | Prizmatix | UHPLCC-01 | |
Digital function generator/amplifier | PASCO | PI-9587C | PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127. |
BNC cable male/male | THORLABS | CA3136 | |
USB-TTL interface | Prizmatix | Optional | |
Photometer | THORLABS | PM50 and Model D10MM | |
Filter paper | Whatman | 1001-110 | |
Copper chloride dihydrate (CuCl2∙2H2O) | Sigma | C6641 | |
Stereomicroscope | Leica | MZ95 | |
NGM plate | Dissolve 5g NaCl, 2.5g Peptone, 20g Agar, 10 µg/ml cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH6.0). | ||
Lysis solution | 10 mM Tris(pH8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X100, 2.5 mM MgCl2, 100 µg/ml Proteinase K |