O uso de Induced Somatic Análise Sector (ISSA) para estudar genes e promotores envolvidos na formação da madeira e Desenvolvimento secundária da haste

Árvore de caules compreendem uma quantidade significativa de biomassa planetas e são de grande importância biológica, cultural e comercial. Hastes secundárias criar habitat, fornecendo recursos e abrigo para muitas outras formas de vida. Eles oferecem muitos outros serviços aos ecossistemas que habitam e agem como um recurso renovável para a produção de madeira, papel e celulose e outros produtos madeireiros e não-madeireiros. desenvolvimento secundária da haste e, mais especificamente, a formação da madeira é regulada pelo sistema complexo molecular que regulam o desenvolvimento de tipos específicos de células, a composição bioquímica das suas paredes celulares e como eles estão dispostos para formar tecidos e órgãos. Dissecando a base molecular do desenvolvimento secundária da haste e formação da madeira é confundida por muitos fatores, incluindo a variabilidade das propriedades da madeira e tronco dentro e entre as hastes, longos tempos de geração, sistemas de Cruzamento de acasalamento, alta heterozigosidade, alta carga genética, dormência sazonal, a longo maduroperíodos estabelecimento traço e o tamanho físico absoluto de árvores maduras. Como resultado, a compreensão do desenvolvimento secundária da haste em relação ao conhecimento detalhado da maioria dos outros aspectos do controle molecular do desenvolvimento da planta, ainda está em sua infância.

Um número de técnicas in vitro têm sido utilizados para estudar o desenvolvimento e compreender secundária da haste, em especial de madeira e a formação da parede celular secundária. Esses protocolos envolvem a utilização de sistemas de parte de planta ou planta inteira, em que ou as plantas transgénicas são criadas ou células ou tecidos específicos secundários são transformados para o estudo de aspectos específicos de madeira e / ou desenvolvimento de ^uma haste secundária. As plantas transgénicas podem ser recuperados transformação pós genética a partir de uma ampla variedade de tecidos de plantas e tipos de células, no entanto, o progresso é lento, especialmente quando se analisa os traços de fibras de madeira devido à longa regeneração e haste tempos de maturação (na ordem de anos), alta técnica e Deman de trabalhods, baixa taxa de transferência de genes candidatos, bem como dificuldades na propagação de algumas espécies de plantas lenhosas. Técnicas similares têm sido desenvolvidos no sistema de modelo não-lenhoso, como Arabidopsis que com sucesso superar algumas destas limitações, mas nem todos os tipos de células-tronco secundárias um presente nestes caules e caracteres relacionados à sazonalidade ou a longevidade não pode ser estudada em tais espécies ^2. Alternativamente, sistemas de parte da planta, tais como Pinu s radiata calos ³ reduzir os prazos associados. Estes métodos são, no entanto restringida ao estudo de um tipo de célula individual e sofrem restrições semelhantes como observado em experiências in vitro. Da mesma forma, as culturas-tronco apicais ⁴ envolvendo explantes-tronco inteiros mostraram-se promissores, mas ainda não foram aplicadas para o estudo de genes ou promotores de interesse específicos. Mais recentemente, um protocolo alternativo envolvendo culturas de raízes peludas tem sido desenvolvido para o eucalipto e tem sido êxitoaplicada ^5, no entanto, este método ainda requer cultivo in vitro, envolve raízes secundárias em vez de hastes e até hoje ela é limitada a uma única espécie de árvore.

Induzida análise do sector somáticas (ISSA), conforme descrito aqui, foi desenvolvido para superar alguns desses problemas fornecendo um meio de alto rendimento ferramenta de triagem funcional para genes e promotores com papéis suspeitos na formação da madeira e desenvolvimento do tecido secundária da haste. ISSA é uma transformação e rastreio sistema in vivo que foi desenvolvido para reduzir o tempo necessário para a produção de células transgénicas e o tecido de uma haste secundária intacta, enquanto a superação de trabalho, limitações técnicas e taxa de transferência de rotina usado em métodos in vitro. Os protocolos aqui descritos permitem a criação simultânea de centenas de sectores tecido transformado de forma independente e células em hastes secundárias dentro de um curto período de tempo, nas espécies de árvores e tecido de interesse sem gvariação enetic e / ou ambiental dentro de prazos relativamente curtos e de baixo custo de trabalho. ISSA em técnicas in vivo foram primeiramente descrita por secundária da haste ⁶ e botão ⁷ tecidos e desde então foi refinado no tecido secundária da haste através de estudos de genes e / ou promotores envolvidos na diferenciação cambial e incluem: tubulina (TUB) ^8, a fasciclina-like arabinogalactan ( FLA) ^9, sintase celulose (CESA) ^10, célula domínio NAC associada a parede secundária (SND2) ^11, ARBORKNOX (ARK1) ¹² e realmente proteína interessante novo gene (ANEL) H2 ^13. Estes estudos foram realizados no secundário caules de plantas de álamo e de eucalipto e fornecidos insights sobre a morfologia das células, química da parede celular e expressão gênica.

Os protocolos descritos aqui têm a intenção de reunir a experiência de umnd conhecimento adquirido através do desenvolvimento e aplicação de ISSA de uma série de estudos publicados e não publicados durante a última década. Eles se concentram na transformação in vivo de tecidos secundária da haste ⁶ e concentrar-se em estudos envolvendo clone Populus alba 'pyramidalis', Eucalyptus globulus, bem como 11 Eucalyptus camaldulensis clones globulus x. Este documento leva pesquisadores através do protocolo a partir do cultivo de plantas e bactérias, a transformação de tecidos do caule, crescimento e colheita de tecido, de identificação das células transgénicas e tecidos, de preparação para as avaliações fenotípicas e métodos para a recolha e análise de dados. Embora as técnicas de sucesso têm sido aplicados para medir a composição monosaccharide parede celular também ^9,11, devido a limitações de espaço, este documento concentra-se em técnicas utilizadas para medir celular e morfologia do tecido e compreender os padrões de expressão de genes em r secundárioems somente. Assim, o protocolo como descrito é ideal para quem procura obter mais insights sobre o papel e / ou expressão de genes ligados ao secundário hastes usando um baixo custo, tecnicamente fácil, e médio e método de alto rendimento.