Dünya Tarım Pest Böcek Embriyo Mikroenjeksiyon yoluyla Nükleik Asitler teslim edilmesi,<em> Ceratitis capitata</em
Summary
The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.
Abstract
Akdeniz meyve sineği (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) son derece yüksek tarımsal alaka ile bir haşere türüdür. Bu, üreme davranışları nedeniyle: Onlar yumurta ve hamuru üzerinde yumurtadan larva yemi yatıyordu zaman kadın meyve ve sebzelerin dış yüzeyine zarar. Vahşi C. capitata popülasyonları geleneksel püskürtme ve / veya çevre dostu yaklaşımlar, en başarılı Steril Böcek Tekniği (SIT) olmak insektisit ile kontrol edilir. SIT kitle yetiştirme, radyasyon bazlı sterilizasyon ve çiftleşmek için kapasitelerini korumak ama verimli döl üretmek mümkün değildir erkeklerin alan salınımı dayanır. gelişi ve birlikte medfly genom dizisinin durumu ile biyoteknolojik araçlar müteakip hızlı bir gelişme, bu türün biyolojisi anlayışımızı artırdı ölçüde olmuştur. Bu genom manipülasyon, ca için yeni stratejiler çoğalmasını tercihn nüfus kontrolü uygulanabilir.
Bu bağlamda, embriyo mikroenjeksiyon medfly kontrolü için araç kutusunu genişleyen ikili bir rol oynar. Anahtar biyolojik süreçleri düzenleyen genlerin fonksiyonu ile müdahale yeteneği, gerçekten, medfly invaziv altında yatan moleküler makine anlayışımızı genişler. Bundan başka, tohum-hattı dönüşümü gerçekleştirmek için yeteneği, yeni SIT ayarları gelecek alan uygulamalar için test edilebilir çok sayıda transgenik soylarının üretilmesini kolaylaştırır. Gerçekten de, genetik manipülasyon, örneğin, alanda erkek steril performansını izlemek için kullanılabilir istenen özellikleri kazandırmak için kullanılabilir, ya da erken yaşam aşamalı öldürücülüğü neden olabilir. İşte bu iki temel hedeflere ulaşmak için medfly embriyolar içine nükleik asitlerin Microinject için bir yöntem açıklanmaktadır.
Introduction
Akdeniz meyve sineği (medfly) Ceratitis capitata kozmopolit bir tür yaygın zarar meyve ve ekili bitkileri olduğunu. Bu tür genera Bactrocera ve Anastrepha ait olanlar gibi bazı böcek türleri içerir Tephritidae ailesine aittir. Medfly Bu ailenin en çok çalışılan türler olduğunu ve böcek istilaları 1 çalışma için değil, aynı zamanda zararlı yönetimi stratejileri 2 optimize etmek için değil, sadece bir model haline gelmiştir.
Medfly 300'den fazla vahşi türler ve ekili bitkiler 3,4 saldırabilir bir multivoltine türdür. hasar yetişkin ve larva aşamaları hem kaynaklanır: çiftleşen dişiler mikroorganizmalar ticari kalitesini etkileyecek izin yumurtlama için meyve yüzeyini delip, pestil üzerinde larva besleme oysa. Üç larva aşamasından sonra, larvalar konak ortaya ve toprağa pupa. Ceratitiscapitata Afrika, Orta Doğu, Batı Avustralya, Orta ve Güney Amerika, Avrupa ve Amerika Birleşik Devletleri 5 alanlar dahil olmak üzere neredeyse tüm dünyada dağıtımı görüntüler.
En yaygın stratejiler medfly enfestasyonlar insektisit kullanımını içerir sınırlamak için (örneğin, Malathion, Spinosad) ve çevre dostu Steril Böcek Tekniği (SIT) 6. İkinci yaklaşım, radyoterapi iyonizan maruz steril hale erkeklerin yüz binlerce vahşi serbest bırakılmasını gerektirir. Yabani dişilere, sterilize erkeklerin birleşme en sonunda ortadan kaldırılması neden popülasyon boyutu bir azalmaya neden hiçbir döl sonuçlanır. SIT dünya çapında birden fazla kampanya etkili olduğu kanıtlanmıştır rağmen, onun büyük dezavantajları yetiştirme ve tahliye edilecek böcekler milyonlarca sterilizasyon yüksek maliyetleri içerir. serbest bireylerin işaretleme sırasında alanda yakalanan yabani böcekler steril ayırmak gerekirfaaliyetlerinin izlenmesi ve şu anda floresan tozu kullanılarak elde edilir. Bu prosedürler, yüksek maliyetli ve istenmeyen yan etkileri 7 vardır.
sipariş optimize etmek ve / veya bu zararlının kontrolünde daha etkili yaklaşımlar geliştirmek için, medfly biyoloji ve genetik yaygın olarak dünya çapında sayısız araştırmacılar tarafından incelenmiştir. Medfly genom dizisinin 8,9 kullanılabilirliği, gen fonksiyonları üzerinde yeni araştırmalar kolaylaştıracaktır. RNA interferans gibi çalışmalar için güçlü bir araç olup, dsRNA (çift zincirli RNA) veya siRNA'nın (küçük müdahale edici RNA) mikroenjeksiyon yoluyla elde edilebilir. Bu teknik göstermek için, örneğin, kullanılmış olduğunu C cinsiyet tespiti moleküler kaskad capitata kısmen Drosophila 10'dakine göre muhafaza edilir.
Protokollerin geliştirilmesi C. izin medfly embriyolar Microinject için capitata olmayan ilk olmak-Drosophilid Sinek türleri genetiği değiştirilmiş olması. Bunu yumurta 11 kuruma hem morfolojik ve direnç açısından, Drosophila benzer olduğu için, protokol önce D. geliştirilmiş ön blastoderm embriyolara plazmid DNA teslim melanogaster 12,13 Başlangıçta C. kullanım için uyarlanmıştır capitata. Bu ilk deneyler transpoze edilebilir elemanın Minos 11 göre medfly germ çizgili transformasyon sağladı. Daha sonra, özgün sistem diğer transpozon tabanlı yaklaşımlar kullanılarak 14 modifiye edildi. Bu Lepidoptera Trichoplusia ni 15 den piggyBac durumdur. Protokol beri daha da optimize edilmiştir ve bu diğer birçok Diptera 22-31 de diğer tephritid türlerinin 16-21 dönüşümü ve izin verdi. Bütün bu sistemler tipik bir ikili vektör / yardımcı plazmid dönüşüm sistemi kullanımına dayanmaktadır: Yapay arızalı transpoİstenen genleri içeren oğulları plasmid DNA içine monte transposaz enzimi 32 tedarik böcek genomuna entegre edilir. Transgenik medfly çizgilerin bir dizi doğruluğunu geliştirmek olabilir, floresan sperm ile suşlar erkek sadece döl üreten ve böylece ilave cinsiyet tayini stratejilerini gerektirmeyen ve suşları, ölümcül uyaran bir koşullu dominant letal geni taşıyan suşlar dahil birden çok özellik ile oluşturulan edilmiştir SİT izleme aşamasında 33-37 arasında. Transgenik organizmaların vahşi salma sivrisinekler, sadece 38,39 karşı Pilot testlerinde meydana gelse de, en az bir adet işletme alanı 40 kullanımları için transgenik medfly bir çok suş veya değerlendirmektedir.
Embriyo mikroenjeksiyon ayrıca (CR gibi transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazların (Talens), kümelenmiş düzenli interspaced kısa yineleyen tekrarlar gibi yeni genom düzenleme araçları, gelişimini desteklemek içinISPR) / CRISPR ilişkili protein 9 nükleaz (Cas9) ve yeni evrimsel ve gelişimsel çalışmaları sağlayacak, hem de mevcut biyoteknolojik araç kutusu genişleyen olacak homing endonükleaz genler (HEGs). Genom düzenleme yaklaşımları zaten sivrisinekler 41 gen-sürücü sistemleri nesil izin ve medfly onların transferi yakındır. Burada her şeyden önce bahsedilen uygulamalarda yararlı olabilir medfly embriyolar nükleik asitlerin microinjecting için evrensel bir protokol açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Böcek embriyolar nükleik asitlerin mikro enjeksiyonu gen fonksiyonu ve biyo teknolojik uygulamalarda analizi hem de kolaylaştırır evrensel bir tekniktir.
böcek türlerinin artan sayıda genom dizilerinin yakın zamanlı henüz bilinmeyen fonksiyonun genlerin fonksiyonel karakterizasyonu için araçlar için acil bir ihtiyaca yol açar. RNA enterferans moleküler fonksiyonları 49 anlaması için en değerli yöntemlerden biri olduğu kanıtlanmıştır ve embriyo mikroenjeks…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank all the members of the “Insect Genetics and Genomics” Laboratory, in particular to Lorenzo Ghiringhelli who has worked at developing, adapting and maintaining the rearing of the medfly over the past thirty years. Part of the representative results of this paper have been reprinted from N. Biotechnology, 25(1) by Scolari F. et al., Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae), 76-84, 2008, with permission from Elsevier (License number 3796240759880). This work received support from Cariplo-Regione Lombardia “IMPROVE” (FS).
Materials
| 1 x injection Buffer | Buffer | 0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5mM KCl | ||
| Construct Plasmid | DNA | |||
| Helper Plasmid | DNA | |||
| dsRNA | RNA | Phenol-Chloroform purified | ||
| Standard Larval food | Rearing Food | 1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products dissolved in 50 ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer’s yeast, 1 kg soft wheat bran | ||
| Carrot Larval Food | Rearing food | 2.5 g Agar, 4 g Sodium Benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86 g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1L | ||
| Adult Food | Rearing food | yeast extract and sugar (1:10) | ||
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | Z692247 | ||
| Injection needles | Eppendorf | 5242956000 | ||
| Microloaders | Eppendorf | 5242956003 | ||
| Double slided tape | ||||
| Whatman Black circle paper | ||||
| Bleach | Generic reagent | Diluite 1:2 before use | ||
| Paintbrush (000) | Generic tool | |||
| Micromanipulator | Instrument | Narishige | MN-153 | |
| Microinjector | Instrument | Eppendorf | Femtojet | |
| Adult cages | Generic tool | |||
| Halocarbon oil 700 | Reagent | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Ceratitis capitata | Animal | The strain used is ISPRA |
Referências
- Diamantidis, A. D., Carey, J. R., Nakas, C. T., Papadopoulos, N. T. Population-specific demography and invasion potential in medfly. Ecol. Evol. 1, 479-488 (2011).
- Augustinos, A. A., et al. Exploitation of the Medfly Gut Microbiota for the Enhancement of Sterile Insect Technique: Use of Enterobacter sp. in Larval Diet-Based Probiotic Applications. PLoS ONE. 10, e0136459 (2015).
- Liquido, N., Shinoda, L., Cunningham, R. Host plants of Mediterranean fruit fly: an annotated World review. Ann Entomol Soc Am. 77, 1-52 (1991).
- Szyniszewska, A. M., Tatem, A. J. Global assessment of seasonal potential distribution of Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). PLoS ONE. 9, e111582 (2014).
- Malacrida, A. R., et al. Globalization and fruitfly invasion and expansion: the medfly paradigm. Genetica. 131, 1-9 (2007).
- Dyck, V. A., Hendrichs, J., Robinson, A. S. . Sterile Insect Technique: Principles and practice in Area-wide Integrated Pest Management. , (2005).
- Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
- Medfly Genome Annotation Groups. Available from: https://www.hgsc.bcm.edu/arthropods/medfly-genome-annotation-groups (2016)
- Pane, A., Salvemini, M., Delli Bovi, P., Polito, C., Saccone, G. The transformer gene in Ceratitis capitata provides a genetic basis for selecting and remembering the sexual fate. Development. 129, 3715-3725 (2002).
- Loukeris, T. G., Livadaras, I., Arcà, B., Zabalou, S., Savakis, C. Gene transfer into the medfly, Ceratitis capitata, with a Drosophila hydei transposable element. Science. 270, 2002-2005 (1995).
- Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218, 348-353 (1982).
- Hoy, M. . Insect Molecular Genetics. An Introduction to Principles and Applications. , (2013).
- Christophides, G. K., Livadaras, I., Savakis, C., Komitopoulou, K. Two medfly promoters that have originated by recent gene duplication drive distinct sex, tissue and temporal expression patterns. Genética. 156, 173-182 (2000).
- Handler, A. M., McCombs, S. D., Fraser, M. J., Saul, S. H. The lepidopteran transposon vector, piggyback, mediates germ-line transformation in the Mediterranean fruit fly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 7520-7525 (1998).
- Handler, A. M., Harrell, R. A. Transformation of the Caribbean fruit fly, Anastrepha suspensa, with a piggyBac vector marked with polyubiquitin-regulated GFP. Insect Biochem Mol Biol. 31, 199-205 (2001).
- Koukidou, M., et al. Germ line transformation of the olive fly Bactrocera oleae using a versatile transgenesis marker. Insect Mol Biol. 15, 95-103 (2006).
- Condon, K. C., et al. Germ-line transformation of the Mexican fruit fly. Insect Mol Biol. 16, 573-580 (2007).
- Raphael, K. A., et al. Germ-line transformation of the Queensland fruit fly, Bactrocera tryoni, using a piggyBac vector in the presence of endogenous piggyBac elements. Genetica. 139, 91-97 (2011).
- Meza, J. S., Nirmala, X., Zimowska, G. J., Zepeda-Cisneros, C. S., Handler, A. M. Development of transgenic strains for the biological control of the Mexican fruit fly, Anastrepha ludens. Genetica. 139, 53-62 (2011).
- Schetelig, M. F., Handler, A. M. Strategy for enhanced transgenic strain development for embryonic conditional lethality in Anastrepha suspensa. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9348-9353 (2012).
- Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
- Allen, M. L., O’Brochta, D. A., Atkinson, P. W., Levesque, C. S. Stable, germ-line transformation of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. 38, 701-710 (2001).
- Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem Mol Biol. 32, 1211-1220 (2002).
- Nolan, T., Bower, T. M., Brown, A. E., Crisanti, A., Catteruccia, F. piggyBac-mediated germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi using the red fluorescent protein dsRED as a selectable marker. J Biol Chem. 277, 8759-8762 (2002).
- Rodrigues, F. G., Oliveira, S. B., Rocha, B. C., Moreira, L. A. Germline transformation of Aedes fluviatilis (Diptera:Culicidae) with the piggyBac transposable element. Mem Inst Oswaldo Cruz. 101, 755-757 (2006).
- Terenius, O., Juhn, J., James, A. A. Injection of An. stephensi embryos to generate malaria-resistant mosquitoes. J Vis Exp. , e216 (2007).
- Jasinskiene, N., Juhn, J., James, A. A. Microinjection of A. aegypti embryos to obtain transgenic mosquitoes. J Vis Exp. , e219 (2007).
- Concha, C., et al. Efficient germ-line transformation of the economically important pest species Lucilia cuprina and Lucilia sericata (Diptera, Calliphoridae). Insect Biochem Mol Biol. 41, 70-75 (2011).
- Takken, W., Scott, T. W. . Ecological Aspects for Application of Genetically Modified Mosquitoes. , (2003).
- Handler, A. M., Handler, A. M., James, A. A. An Introduction to the History and Methodology of Insect Gene Transfer. Insect transgenesis: methods and applications. , 3-26 (2000).
- Handler, A. M. A current perspective on insect gene transformation. Insect Biochem Mol Biol. 31, 111-128 (2001).
- Gong, P., et al. A dominant lethal genetic system for autocidal control of the Mediterranean fruitfly. Nat. Biotechnol. 23, 453-456 (2005).
- Scolari, F., et al. Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae). N Biotechnol. 25, 76-84 (2008).
- Schetelig, M. F., et al. Site-specific recombination for the modification of transgenic strains of the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18171-18176 (2009).
- Schetelig, M. F., Caceres, C., Zacharopoulou, A., Franz, G., Wimmer, E. A. Conditional embryonic lethality to improve the sterile insect technique in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). BMC Biol. 7, 4 (2009).
- Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochem Mol Biol. 43, 1-8 (2013).
- Lacroix, R., et al. Open field release of genetically engineered sterile male Aedes aegypti in Malaysia. PLoS ONE. 7, e42771 (2012).
- Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nat. Biotechnol. 30, 828-830 (2012).
- Leftwich, P. T., et al. Genetic elimination of field-cage populations of Mediterranean fruit flies. Proc. Biol. Sci. 281, (2014).
- Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, E6736-E6743 (2015).
- Economopoulos, A. P., Judt, S. Artificial Rearing of the Mediterranean Fruit Fly (Diptera: Tephritidae): Size of Oviposition Holes. J. Econ. Entomol. 82, 668-674 (1989).
- Thailayil, J., Magnusson, K., Godfray, H. C., Crisanti, A., Catteruccia, F. Spermless males elicit large-scale female responses to mating in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 13677-13681 (2011).
- Gilbert, L. . Insect Development. Morphogenesis, Molting and Metamorphosis. , (2009).
- Schetelig, M. F., Horn, C., Handler, A. M., Wimmer, E. A., Vreysen, M. J., Robinson, A., Hendrichs, J. . Area-Wide control of insect pests. From research to field implementation. , 85-93 (2007).
- Gabrieli, P., et al. Sex and the single embryo: early development in the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Dev Biol. 10, 12 (2010).
- Tazuke, S. I., et al. A germline-specific gap junction protein required for survival of differentiating early germ cells. Development. 129, 2529-2539 (2002).
- Gabrieli, P., Marois, E., Catteruccia, F., Benedict, M. Q. . Transgenic insects: techniques and applications. , 188-207 (2014).
- Scolari, F., et al. How functional genomics will impact fruit fly pest control: the example of the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Genet. 15, S11 (2014).
- Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).
- Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
