تسليم الأحماض النووية من خلال حقن مكروي الأجنة في مكافحة الحشرات الحشرات الزراعية العالمية،<em> آفة Ceratitis الرؤيسية</em
Summary
The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.
Abstract
ذبابة فاكهة البحر الأبيض المتوسط (medfly) آفة Ceratitis الرؤيسية (فيدمان) (ذوات الجناحين: ذبابة منزلية) هو نوع من الآفات ذات الأهمية الزراعية مرتفعة للغاية. ومن المقرر أن سلوكها الإنجابي هذا: الإناث تلف السطح الخارجي من الفواكه والخضروات عندما تضع بيضها وتغذية اليرقات على لب بهم. البرية C. يتم التحكم في السكان الرؤيسية تقليديا من خلال رش مبيدات الحشرات و / أو النهج الصديقة للبيئة، والأكثر نجاحا يجري تقنية الحشرة العقيمة (SIT). تعتمد SIT على كتلة تربية والتعقيم القائم على الإشعاع وإطلاق المجال للذكور التي تحتفظ قدرتها على زميله ولكنها ليست قادرة على توليد ذرية خصبة. ظهور والتطور السريع لاحقة من أدوات التكنولوجيا الحيوية، جنبا إلى جنب مع توافر تسلسل الجينوم medfly، وعززت بشكل كبير من فهمنا للبيولوجيا من هذا النوع. هذا يفضل انتشار استراتيجيات جديدة للتلاعب الجينوم، الذي كاليفورنيان أن تطبق على التحكم في عدد السكان.
في هذا السياق، الجنين حقن مكروي يلعب دورا مزدوجا في توسيع الأدوات للسيطرة medfly. القدرة على تتداخل مع وظيفة الجينات التي تنظم العمليات الحيوية الأساسية، في الواقع، ويوسع فهمنا لآلية الجزيئية الكامنة وراء الغزو medfly. وعلاوة على ذلك، فإن القدرة على تحقيق التحول خط الجرثومية تسهل إنتاج سلالات معدلة وراثيا المتعددة التي يمكن اختبارها للتطبيقات الميدانية في المستقبل في إعدادات SIT جديدة. في الواقع، والتلاعب الجيني يمكن أن تستخدم لإضفاء الصفات المرغوبة التي يمكن، على سبيل المثال، يمكن استخدامها لمراقبة أداء الذكور العقيمة في هذا المجال، أو التي يمكن أن تؤدي في وقت مبكر الفتك مرحلة الحياة. نحن هنا تصف طريقة لmicroinject الأحماض النووية في الأجنة medfly لتحقيق هذه الأهداف الرئيسيين.
Introduction
ذبابة فاكهة البحر المتوسط (medfly) آفة Ceratitis الرؤيسية هو نوع عالمية أن على نطاق واسع الأضرار الفواكه والمحاصيل الزراعية. وهو ينتمي إلى عائلة ذبابة منزلية، والتي تشمل عدة أنواع الآفات، مثل أولئك الذين ينتمون إلى أجناس Bactrocera وAnastrepha. وmedfly هي الأنواع الأكثر درس من هذه العائلة، وأصبح نموذجا ليس فقط لدراسة الغزوات الحشرات 1، ولكن أيضا لتحسين استراتيجيات إدارة الآفات 2.
وmedfly هي الأنواع multivoltine التي يمكن أن تهاجم أكثر من 300 نوع من الحياة البرية والنباتات المزروعة 3،4. وسبب الضرر من قبل كل من البالغين ومراحل اليرقات: الإناث تزاوج تخترق سطح الفاكهة لوضع البيض، مما يسمح للميكروبات لتؤثر على نوعية التجارية الخاصة بهم، في حين أن تتغذى اليرقات على لب الفاكهة. بعد ثلاث مراحل اليرقات، تخرج اليرقات من المضيف وتخدر تصبح خادرة في التربة. آفة Ceratitisيعرض الرؤيسية التوزيع في جميع أنحاء العالم تقريبا، بما في ذلك أفريقيا والشرق الأوسط واستراليا الغربية والوسطى وأمريكا الجنوبية وأوروبا ومناطق من الولايات المتحدة 5.
الاستراتيجيات الأكثر شيوعا للحد من تفشي medfly تنطوي على استخدام المبيدات الحشرية (على سبيل المثال، الملاثيون، Spinosad) وصديقة للبيئة تقنية الحشرة العقيمة (SIT) 6. ويشمل هذا النهج الأخير لإطلاقها في البرية من مئات الآلاف من الذكور المقدمة عقيمة عن التعرض لأشعة المؤينة. التزاوج لهذه الذكور المعقمة للإناث البرية النتائج في أي ذرية، مما تسبب في انخفاض في حجم السكان، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى القضاء. على الرغم من أن SIT أثبت فعاليته في عدة حملات في جميع أنحاء العالم، وتشمل العوائق الرئيسية لارتفاع تكاليف تربية وتعقيم الملايين من الحشرات التي ستصدر. تمييز الأفراد الذين أطلق سراحهم من الضروري التمييز عقيمة من الحشرات البرية المأسورة في الميدان خلالرصد أنشطة وتحقيقه حاليا باستخدام مساحيق الفلورسنت. هذه الإجراءات مكلفة ولها آثار جانبية غير مرغوب فيها-7.
من أجل تحسين و / أو لوضع نهج أكثر فعالية لمكافحة هذه الآفة، تم استكشافها على نطاق واسع البيولوجيا البحر المتوسط وذبابة علم الوراثة من قبل العديد من الباحثين في جميع أنحاء العالم. توافر تسلسل الجينوم medfly 8،9، سيسهل التحقيقات رواية على وظائف الجينات. تدخل الحمض النووي الريبي هو أداة قوية لمثل هذه الدراسات، وأنه يمكن أن يتحقق من خلال Microinjection من الرنا المزدوج الجديلة (RNA المزدوج تقطعت بهم السبل) أو سيرنا (صغير التدخل RNA). وقد استخدمت هذه التقنية، على سبيل المثال، لإثبات أن سلسلة الجزيئية تحديد الجنس في C. يتم حفظها الرؤيسية إلا جزئيا فيما يتعلق بهذه ذبابة الفاكهة 10.
وضع بروتوكولات لmicroinject الأجنة medfly يسمح C. الرؤيسية ليكون أول غيرذباب -Drosophilid لتعديلها وراثيا. كما بيوضها مماثلة لتلك التي من ذبابة الفاكهة، سواء من حيث الشكل ومقاومة للجفاف 11، وبروتوكول لتقديم DNA البلازميد في الأجنة قبل الأريمة ضعت أول لد. البطن 12،13 تم تكييفها في البداية لاستخدامها في C. الرؤيسية. هذه التجارب الأولى سمحت medfly تحول خط الجرثومية والتى ترتكز على جين قافز مينوس 11. وفي وقت لاحق، تم تعديل النظام الأصلي 14 باستخدام النهج الأخرى القائمة على ينقول. هذا هو حال piggyBac من حرشفية الأجنحة Trichoplusia ني 15. بروتوكول منذ ذلك الحين أبعد الأمثل وهذا ما يسمح للتحول من الأنواع الأخرى tephritid 16-21 وكذلك غيرها الكثير من ذوات الجناحين 22-31. جميع هذه الأنظمة تعتمد على استخدام ناقلات / المساعد نظام التحول البلازميد ثنائي نموذجي: الاصطناعي، TRANSPO معيبيتم تجميع أبناء تحتوي على الجينات المطلوبة إلى البلازميد ودمجها في جينوم الحشرات من خلال تزويد انزيم ترانسبوزاز 32. تم إنشاء عدد من خطوط medfly المعدلة وراثيا، مع ميزات متعددة بما في ذلك سلالات يحمل الجينات القاتلة المهيمنة المشروط أن يدفع الفتك، من السلالات المنتجة للذكور فقط ذرية، وبالتالي لا تتطلب استراتيجيات سإكسينغ] إضافية، والتوترات مع الحيوانات المنوية الفلورسنت، الأمر الذي قد يعزز دقة من مرحلة المراقبة SIT 33-37. وعلى الرغم من الافراج عنه في البرية من الكائنات المعدلة وراثيا قد وقعت في الاختبارات التجريبية ضد البعوض فقط 38،39، شركة واحدة على الأقل وتقييم عدد من سلالات medfly المعدلة وراثيا لاستخدامها في مجال 40.
يمكن أن الجنين حقن مكروي مواتية أيضا لتطوير أدوات الجينوم تحرير جديدة، مثل النسخ الشبيهة المنشط nucleases المستجيب (TALENs)، تتجمع interspaced بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (CRISPR) / كريسبر بروتين يرتبط 9 نوكلياز (Cas9) ونوكلياز داخلي مؤلف الجينات (HEGs)، مما سيمكن الدراسات التطورية والتنموية الجديدة، فضلا عن توسيع الأدوات التكنولوجية الحيوية المتاحة. يسمح النهج الجينوم التحرير بالفعل جيل من أنظمة الدفع الجينات في البعوض 41، ونقلهم إلى medfly بات وشيكا. نحن هنا وصف بروتوكول عالمي لmicroinjecting الأحماض النووية في الأجنة medfly التي يمكن أن تكون مفيدة لجميع التطبيقات المذكورة أعلاه.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microinjection من الأحماض النووية في الأجنة الحشرات هي تقنية عالمية تسهل كل من تحليل وظيفة الجين والتطبيقات التكنولوجية الحيوية.
نشر مؤخرا من تسلسل الجينوم من عدد متزايد من أنواع الحشرات يؤدي إلى الحاجة الملحة لأدوات لتوصيف وظيفي من ا?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank all the members of the “Insect Genetics and Genomics” Laboratory, in particular to Lorenzo Ghiringhelli who has worked at developing, adapting and maintaining the rearing of the medfly over the past thirty years. Part of the representative results of this paper have been reprinted from N. Biotechnology, 25(1) by Scolari F. et al., Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae), 76-84, 2008, with permission from Elsevier (License number 3796240759880). This work received support from Cariplo-Regione Lombardia “IMPROVE” (FS).
Materials
| 1 x injection Buffer | Buffer | 0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5mM KCl | ||
| Construct Plasmid | DNA | |||
| Helper Plasmid | DNA | |||
| dsRNA | RNA | Phenol-Chloroform purified | ||
| Standard Larval food | Rearing Food | 1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products dissolved in 50 ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer’s yeast, 1 kg soft wheat bran | ||
| Carrot Larval Food | Rearing food | 2.5 g Agar, 4 g Sodium Benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86 g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1L | ||
| Adult Food | Rearing food | yeast extract and sugar (1:10) | ||
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | Z692247 | ||
| Injection needles | Eppendorf | 5242956000 | ||
| Microloaders | Eppendorf | 5242956003 | ||
| Double slided tape | ||||
| Whatman Black circle paper | ||||
| Bleach | Generic reagent | Diluite 1:2 before use | ||
| Paintbrush (000) | Generic tool | |||
| Micromanipulator | Instrument | Narishige | MN-153 | |
| Microinjector | Instrument | Eppendorf | Femtojet | |
| Adult cages | Generic tool | |||
| Halocarbon oil 700 | Reagent | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Ceratitis capitata | Animal | The strain used is ISPRA |
Referências
- Diamantidis, A. D., Carey, J. R., Nakas, C. T., Papadopoulos, N. T. Population-specific demography and invasion potential in medfly. Ecol. Evol. 1, 479-488 (2011).
- Augustinos, A. A., et al. Exploitation of the Medfly Gut Microbiota for the Enhancement of Sterile Insect Technique: Use of Enterobacter sp. in Larval Diet-Based Probiotic Applications. PLoS ONE. 10, e0136459 (2015).
- Liquido, N., Shinoda, L., Cunningham, R. Host plants of Mediterranean fruit fly: an annotated World review. Ann Entomol Soc Am. 77, 1-52 (1991).
- Szyniszewska, A. M., Tatem, A. J. Global assessment of seasonal potential distribution of Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). PLoS ONE. 9, e111582 (2014).
- Malacrida, A. R., et al. Globalization and fruitfly invasion and expansion: the medfly paradigm. Genetica. 131, 1-9 (2007).
- Dyck, V. A., Hendrichs, J., Robinson, A. S. . Sterile Insect Technique: Principles and practice in Area-wide Integrated Pest Management. , (2005).
- Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
- Medfly Genome Annotation Groups. Available from: https://www.hgsc.bcm.edu/arthropods/medfly-genome-annotation-groups (2016)
- Pane, A., Salvemini, M., Delli Bovi, P., Polito, C., Saccone, G. The transformer gene in Ceratitis capitata provides a genetic basis for selecting and remembering the sexual fate. Development. 129, 3715-3725 (2002).
- Loukeris, T. G., Livadaras, I., Arcà, B., Zabalou, S., Savakis, C. Gene transfer into the medfly, Ceratitis capitata, with a Drosophila hydei transposable element. Science. 270, 2002-2005 (1995).
- Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218, 348-353 (1982).
- Hoy, M. . Insect Molecular Genetics. An Introduction to Principles and Applications. , (2013).
- Christophides, G. K., Livadaras, I., Savakis, C., Komitopoulou, K. Two medfly promoters that have originated by recent gene duplication drive distinct sex, tissue and temporal expression patterns. Genética. 156, 173-182 (2000).
- Handler, A. M., McCombs, S. D., Fraser, M. J., Saul, S. H. The lepidopteran transposon vector, piggyback, mediates germ-line transformation in the Mediterranean fruit fly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 7520-7525 (1998).
- Handler, A. M., Harrell, R. A. Transformation of the Caribbean fruit fly, Anastrepha suspensa, with a piggyBac vector marked with polyubiquitin-regulated GFP. Insect Biochem Mol Biol. 31, 199-205 (2001).
- Koukidou, M., et al. Germ line transformation of the olive fly Bactrocera oleae using a versatile transgenesis marker. Insect Mol Biol. 15, 95-103 (2006).
- Condon, K. C., et al. Germ-line transformation of the Mexican fruit fly. Insect Mol Biol. 16, 573-580 (2007).
- Raphael, K. A., et al. Germ-line transformation of the Queensland fruit fly, Bactrocera tryoni, using a piggyBac vector in the presence of endogenous piggyBac elements. Genetica. 139, 91-97 (2011).
- Meza, J. S., Nirmala, X., Zimowska, G. J., Zepeda-Cisneros, C. S., Handler, A. M. Development of transgenic strains for the biological control of the Mexican fruit fly, Anastrepha ludens. Genetica. 139, 53-62 (2011).
- Schetelig, M. F., Handler, A. M. Strategy for enhanced transgenic strain development for embryonic conditional lethality in Anastrepha suspensa. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9348-9353 (2012).
- Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
- Allen, M. L., O’Brochta, D. A., Atkinson, P. W., Levesque, C. S. Stable, germ-line transformation of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. 38, 701-710 (2001).
- Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem Mol Biol. 32, 1211-1220 (2002).
- Nolan, T., Bower, T. M., Brown, A. E., Crisanti, A., Catteruccia, F. piggyBac-mediated germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi using the red fluorescent protein dsRED as a selectable marker. J Biol Chem. 277, 8759-8762 (2002).
- Rodrigues, F. G., Oliveira, S. B., Rocha, B. C., Moreira, L. A. Germline transformation of Aedes fluviatilis (Diptera:Culicidae) with the piggyBac transposable element. Mem Inst Oswaldo Cruz. 101, 755-757 (2006).
- Terenius, O., Juhn, J., James, A. A. Injection of An. stephensi embryos to generate malaria-resistant mosquitoes. J Vis Exp. , e216 (2007).
- Jasinskiene, N., Juhn, J., James, A. A. Microinjection of A. aegypti embryos to obtain transgenic mosquitoes. J Vis Exp. , e219 (2007).
- Concha, C., et al. Efficient germ-line transformation of the economically important pest species Lucilia cuprina and Lucilia sericata (Diptera, Calliphoridae). Insect Biochem Mol Biol. 41, 70-75 (2011).
- Takken, W., Scott, T. W. . Ecological Aspects for Application of Genetically Modified Mosquitoes. , (2003).
- Handler, A. M., Handler, A. M., James, A. A. An Introduction to the History and Methodology of Insect Gene Transfer. Insect transgenesis: methods and applications. , 3-26 (2000).
- Handler, A. M. A current perspective on insect gene transformation. Insect Biochem Mol Biol. 31, 111-128 (2001).
- Gong, P., et al. A dominant lethal genetic system for autocidal control of the Mediterranean fruitfly. Nat. Biotechnol. 23, 453-456 (2005).
- Scolari, F., et al. Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae). N Biotechnol. 25, 76-84 (2008).
- Schetelig, M. F., et al. Site-specific recombination for the modification of transgenic strains of the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18171-18176 (2009).
- Schetelig, M. F., Caceres, C., Zacharopoulou, A., Franz, G., Wimmer, E. A. Conditional embryonic lethality to improve the sterile insect technique in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). BMC Biol. 7, 4 (2009).
- Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochem Mol Biol. 43, 1-8 (2013).
- Lacroix, R., et al. Open field release of genetically engineered sterile male Aedes aegypti in Malaysia. PLoS ONE. 7, e42771 (2012).
- Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nat. Biotechnol. 30, 828-830 (2012).
- Leftwich, P. T., et al. Genetic elimination of field-cage populations of Mediterranean fruit flies. Proc. Biol. Sci. 281, (2014).
- Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, E6736-E6743 (2015).
- Economopoulos, A. P., Judt, S. Artificial Rearing of the Mediterranean Fruit Fly (Diptera: Tephritidae): Size of Oviposition Holes. J. Econ. Entomol. 82, 668-674 (1989).
- Thailayil, J., Magnusson, K., Godfray, H. C., Crisanti, A., Catteruccia, F. Spermless males elicit large-scale female responses to mating in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 13677-13681 (2011).
- Gilbert, L. . Insect Development. Morphogenesis, Molting and Metamorphosis. , (2009).
- Schetelig, M. F., Horn, C., Handler, A. M., Wimmer, E. A., Vreysen, M. J., Robinson, A., Hendrichs, J. . Area-Wide control of insect pests. From research to field implementation. , 85-93 (2007).
- Gabrieli, P., et al. Sex and the single embryo: early development in the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Dev Biol. 10, 12 (2010).
- Tazuke, S. I., et al. A germline-specific gap junction protein required for survival of differentiating early germ cells. Development. 129, 2529-2539 (2002).
- Gabrieli, P., Marois, E., Catteruccia, F., Benedict, M. Q. . Transgenic insects: techniques and applications. , 188-207 (2014).
- Scolari, F., et al. How functional genomics will impact fruit fly pest control: the example of the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Genet. 15, S11 (2014).
- Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).
- Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
