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Genética

In Situ Rotulagem de replicação de DNA mitocondrial em Drosophila Adulto Ovários por Edu Coloração

Published: October 15, 2016
doi:
10.3791/54516
,
1Lab of Molecular Genetics, National Heart, Lung and Blood Institute,National Institutes of Health

Summary

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

Abstract

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2´-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.

Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

Introduction

Além do genoma nuclear, cada célula eucariótica também contém milhares de cópias de DNA circular pequena na matriz mitocondrial. Enquanto DNA mitocondrial (mtDNA) codifica subunidades essenciais da cadeia de transporte de electrões, a maioria do proteoma mitocondrial, incluindo todos os factores de replicação e transcrição de mtDNA são codificados pelo genoma nuclear. Em contraste com o genoma nuclear que segue as leis da hereditariedade mendeliana, o genoma mitocondrial animais é herdado exclusivamente através da linhagem materna. Portanto, compreender como mtDNA é proliferaram e transmitida de uma geração para a outra através do oócito feminino é de fundamental importância. No entanto, há um debate contínuo sobre a forma como a replicação mtDNA é regulada na linha germinativa feminina. Além disso, a teoria gargalo mtDNA amplamente aceites para a transmissão de mtDNA sugere que a população de mtDNA em células germinativas primordiais é sub-amostrado a um número relativamente pequeno durang desenvolvimento 1 2. Implica também que a replicação do mtDNA é temporal e espacialmente regulamentado durante oogenesis. Assim, a detecção in situ de replicação mtDNA durante o desenvolvimento da linha germinativa irá facilitar a compreensão do mecanismo de herança mtDNA.

Drosophila oogenesis fornece um sistema geneticamente tratável para estudar a replicação mtDNA e transmissão. Em cada um dos dois ovários de Drosophila, existem 16-20 cadeias independentes de câmaras de ovo chamados ovarioles 3, que são as unidades funcionais de produção de ovos (ver Figura 1A). Cada ovaríolo contém uma organização linear progressiva de oog�ese, onde a ponta anterior é composto de uma estrutura chamada germário. O germário é ainda dividido em quatro regiões que contêm as células germinativas em diferentes estágios de desenvolvimento. Na região 1, as células-tronco germinativas passam por divisão assimétrica para produzir células filhas conhecidos como cystoblasts. Região 2a contém os cistoblastos que tenham concluído a sua divisão final. Cistoblastos sofrer quatro rodadas de grupos de 16 Divisão Celular produzindo. As células 16 permanecem ligadas umas às outras por pontes citoplasmáticas chamados canais de anel. Apenas uma das células compromete-se a diferenciação como o oócito, enquanto o outro 15 desenvolver-se como células poliplóides enfermeira. Uma estrutura citoplasmática essencial, conhecido como fusoma, é proposto para facilitar com a formação de canais de anel, determinar a polaridade cisto e a enfermeira interacções célula-oócitos 4,5. Como os cistos avançar para 2b região, as estruturas de quisto abranger toda a largura do germário, e tornar-se mais associado com as células do folículo. As estruturas germário acabar com a região 3 que contém a primeira câmara de ovo brotamento. Subsequentemente, as câmaras de ovo são montados na extremidade posterior da germário, que progridem através do ovaríolo em 14 etapas morfologicamente distintas. O crescimento do oócito depende das células enfermeira, WHproteínas de transporte ich, mRNA e estruturas endomembrane (por exemplo, de Golgi) através dos canais de anel para o oócito. Durante Drosophila oog�ese, verificou-se que uma fracção de mitocôndrias em cada cisto 16 células foram associados com a fusoma, mudou-se através dos canais de anel e foram entregues no único oócito em uma grande massa chamada Balbiani corpo 6. Este fenômeno foi proposta para contribuir para o controle de qualidade de herança mitocondrial através de ovários femininos.

Detecção de síntese mtDNA baseia-se na incorporação de precursores de ADN marcados no ADN celular. Tradicionalmente, um análogo de nucleósido de timidina 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) foi utilizado para marcar o mtDNA de replicação em células de cultura de tecidos de 7,8. No entanto, a rotulagem BrdU à base de anticorpo apresenta várias limitações, especialmente para a coloração de tecidos whole-mount. Uma grande desvantagem da marcação com BrdU é que requer a desnaturação do ADN para exporo epitopo de BrdU, de modo que pode ser detectada pelo anticorpo anti-BrdU. A amostra tem que ser tratada sob condições de desnaturação duras, tais como produtos químicos (por exemplo, ácido clorídrico ou misturas de metanol e ácido acético), calor, ou digestão com ADNase, o que poderia interromper a estrutura da amostra e complicam o seguinte procedimento de coloração 9, 10.

Aqui, uma alternativa timidina análogo 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) é utilizado para marcar o ADN mitocondrial replicar em ovários adulto de Drosophila. Este método é mais rápido e altamente sensível. EdU é prontamente incorporado no ADN celular durante a replicação do ADN. A detecção que se segue baseia-se numa reacção "clique", Cu (I) catalisada por reacção covalente entre o grupo alcino terminal e uma azida fluorescente 10. Uma vez que a reacção não requer a desnaturação do espécime, que permite uma boa conservação estrutural. Além disso, o tamanho de um coranteZide só é 1/500 de que uma molécula de anticorpo de 10, o que permite a penetração rápida e eficiente de tecidos conjunto de montagem. Temos utilizado este método para detectar replicação mtDNA durante Drosophila oogenesis e encontrou um padrão espacial marcante na região germário de Drosophila ovário 11, o que nos levou a propor um mecanismo de herança mtDNA seletiva dependentes de replicação. Nós apresentamos aqui um protocolo detalhado sobre rotulagem EdU da replicação do mtDNA em ovários de Drosophila. Para demonstrar a aplicação do protocolo, que também testou a replicação do mtDNA em mtDNA mutante de Drosophila (mt: CoI T300I) 11, bem como com o tratamento de diversas desacopladores mitocondriais, que dissipam o potencial de membrana mitocondrial e, potencialmente, perturbam a replicação do mtDNA.

Protocol

1. Tissue Recolha e Dissection Em cada frasco contendo levedura seca, a cultura 10 adultos do sexo feminino voa com 10 homens para 2-3 dias. Nota: Manter as moscas fêmeas bem alimentados irá melhorar a qualidade global eo rendimento da produção de ovário e facilitar a dissecção. Anestesiar a fêmea voa em um dióxido de carbono (CO 2) Voa pad. Sob o estereoscópio, colocar várias gotas de meio de RT (meio de Drosophila de Schneider suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS)) em uma almofada de dissecação. Realizar todos os procedimentos de dissecação na média a manter os tecidos vivos e saudáveis. Agarrar uma fêmea engordados voar com uma pinça fina de nariz nítidas em seu tórax inferior. Use um outro conjunto de pinça para puxar delicadamente na posterior extremo da mosca até que os tecidos do abdômen estão expostos. Retire os dois ovários de outros tecidos (por exemplo, tripas). Nota: cada ovário exibe uma estrutura opaca que é compord de 16-20 ovarioles anexas. Para aumentar a penetração de reagentes, abrir os ovários, puxando-os separados e passando as pontas das pinças em cada ovaríolo entre um par de vezes. Manter as ovarioles ligados dentro de um ovário para minimizar a perda de tecidos durante os seguintes procedimentos. Transferir os ovários imediatamente para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 500 ul de meio de Drosophila de Schneider com 10% de FBS. Repita a dissecção e recolher 10-15 ovários em cada tubo de microcentrífuga. 2. EdU Labeling Aspirar o meio em cada tubo, e substituir com 500 ul de meio de Drosophila de Schneider com 10% de FBS contendo 7 ^ M de afidicolina. Nota: A afidicolina é utilizado para bloquear a síntese de ADN nuclear através da inibição da polimerase de ADN α sem afectar a replicação do mtDNA 7, 12. É possível aumentar a concentração acima de afidicolinaa 70 uM para conseguir uma melhor inibição. A solução estoque de afidicolina 3-30 mM em DMSO pode ser armazenada no escuro a -20 ° C durante até 6 semanas. Para manter os ovários saudável, garantir que eles estão imersos sob soluções ao mudar o meio. Use meio de Drosophila de Schneider com 10% de FBS até a etapa 2.6. Incubar ovários durante 3 horas à temperatura ambiente num agitador de bancada com rotação suave. Para o tratamento de drogas, por exemplo, cianeto de desacoplador mitocondrial carbonil fenil-hidrazona 4-trifluorometoxi (FCCP), adicionar a concentração apropriada de droga (por exemplo, 10 uM FCCP) para o meio após 2 horas de tratamento com afidicolina. Continuar a incubação durante mais 1 h. Remover o meio contendo afidicolina com ou sem fármaco. Resumidamente enxaguar os ovários com meio (afidicolina não é necessário) duas vezes. Adicionar 1 ml de meio contendo 10 uM EdU e 7 | iM de afidicolina e continuar incubating à temperatura ambiente durante 2 h. Guardar a solução estoque de 10 mM EdU (em DMSO) a -20 ° C. Remova o meio contendo EdU e afidicolina. Lave com meio (sem afidicolina) duas vezes por 3 min cada um. 3. Tissue Fixação e permeabilização Prepara-se uma solução de paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4). Observação: Usamos comercial disponível paraformaldeído armazenado em ampolas pré-marcados. Abra uma nova ampola e diluir a 4% antes da utilização. CUIDADO: O formaldeído é tóxico; que deve ser manuseado em um exaustor com a pele e proteção para os olhos. Fix ovários com 4% de paraformaldeído durante 20 min à temperatura ambiente com rotação suave. Remover o fixador e lava-se duas vezes ovários em 1 ml de BSA a 3% em PBS durante 5 min de cada vez. Para permeabilizar as tecidos, remover a solução de lavagem e adicionar 1 ml de 0,5% de Triton X-100 em PBS. Incubar à temperatura ambiente durante 20 min. Remover a solução de permeabilização e lavar duas vezes em 1 mlde 3% de BSA em PBS. 4. Detecção EdU Nota: EdU detecção baseia-se na química "clique", Cu (I) catalisada por [3 + 2] cicloadição 13, que adiciona as azidas fluorescentes ao grupo alcino terminal da edu, e a molécula fluorescente é submetida a detecção subsequente. Desde Cu (I), o qual é facilmente oxidado para as espécies não catalíticas de Cu (II), é necessária para catalisar a reacção, recomenda-se reduzir o (II) sulfato de Cu in situ para se obter Cu (I). Isto é, Cu sulfato (II) é utilizado na presença de um redutor tal como o ácido ascórbico (aqui o "tampão aditivo") para gerar cobre (I). Antes do experimento, preparar a solução de trabalho da azida Alexa Fluor (Alexa Fluor 488 azida, Alexa Fluor 555 azida ou outros, dependendo do fluoróforo preferida, as quais são designadas como "corante azida" daqui em diante), tampão de reacção EdU e tampão EdU aditivo de acordo com o fabricanteinstruções. Reconstituir o corante azida em 70 mL de DMSO. Guardar a solução de trabalho à temperatura de -20 ° C durante até 1 ano. Preparar tampão fresco reacção EdU diluindo a EdU tampão 10x reacção com água deionizada. Nota: Após o uso, armazenar qualquer solução 1x restante a 4 ° C. A solução 1x é estável por até 6 meses. Faça uma solução 10x estoque do aditivo tampão EdU dissolvendo completamente o pó em 2 mL de água deionizada. Nota: Esta solução é estável durante até 1 ano à temperatura de -20 ° C. Se a solução desenvolve uma cor castanha, que foi degradada e deverá ser descartado. Prepare o coquetel de reacção EdU fresco de cada vez, e utilizar no prazo de 15 min de preparação. Para obter resultados reprodutíveis, certifique-se os componentes da reacção são mantidas nas mesmas proporções. Adicione fresco 1x tampão EdU solução aditiva por diluição da solução estoque 10x (preparado no passo 4.1.3) 1:10 em água desionizada. Utilize este sOlution no mesmo dia. Prepare 1 ml de cocktail EdU reacção através da combinação dos seguintes ingredientes por ordem: 860 ul EdU 1x tampão de reacção, 40 ul de CuSO 4, 2,5 uL de corante de azida, 100 ul de 1x tampão de EdU aditivo. Nota: É importante que os ingredientes são adicionados a fim de assegurar um desempenho óptimo. Remover o PBS com BSA a 3% e adicionar 0,5 ml do cocktail de reacção EdU a cada tubo. Incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos com rotação suave. Manter as amostras protegidas da luz. Remover o cocktail de reacção EdU e lavar uma vez com 1 ml de BSA a 3% em PBS. Lavam-se as amostras de uma vez com 1 ml de PBS. 5. Rotulagem de anticorpos Nota: Execute rotulagem de anticorpos após a coloração EdU. Se nenhuma coloração adicional é desejado, pode-se proceder à montagem e de imagem directamente. É importante que as amostras de ser protegida da luz em todos os seguintes procedimentos. Remover a solução de lavagem. Bloquear os ovários em 1 ml de solução de bloqueio contendo 0,2% de BSA e 0,1% de Triton X-100 em PBS durante 30 min. Remover a solução de bloqueio e substituir com anticorpo primário diluído em solução de bloqueio (por exemplo, rato ATP sintase subunidade α anticorpo, diluição 1: 1000). Incubar no escuro a 4 ° CO / N. Lavam-se as amostras com 1 ml de solução de bloqueio 3 vezes, 10 min de cada vez. Para minimizar o fundo, lavar mais duas vezes durante 30 minutos cada. Remover a solução de bloqueio. Incubar com anticorpo secundário diluído em solução de bloqueio (por exemplo, anticorpo secundário de cabra anti-rato Alexa Fluor 568, diluição 1: 200) durante 2 horas à TA. Nota: Use uma cor diferente do que acoplado a EdU. Repita os passos de lavagem executados no passo 5.3. Lavar com 1 ml de PBS uma vez para remover o detergente. 6. Montagem e imagem Remova cuidadosamente todo o PBS e immediately cobrir ovários com 50 ul de meio de montagem (com ou sem DAPI). Nota: Utilizar um meio de montagem que não endurecer enquanto os ovarioles estão a ser separadas umas das outras. Os ovários podem ser armazenadas em meio de montagem, a 4 ° C durante até uma semana. Cortar a extremidade de uma ponta de pipeta e usá-lo para transferir ovários cuidadosamente sobre uma lâmina de microscópio. Completamente separado cada ovaríolo com uma pinça fina de nariz afiadas sob o microscópio estereoscópico. Remover os tecidos de ligação na extremidade posterior e estágio 14 ou câmaras de ovos maduros. As câmaras de ovo jovens estão na extremidade anterior e transparente. Alinhar as câmaras de ovo com uma pinça, para que eles não se sobrepõem uns com os outros. Lentamente inferior uma lamela de vidro # 1.5 na parte superior das amostras. Permitir que o meio de montagem para polimerizar durante várias horas à temperatura ambiente. Selo com unha polonês transparente. Imagem desliza no dia seguinte, ou armazenar a 4 ° C antes da imagem. Visualize sob a mi confocalcroscope com um objetivo de imersão em óleo 63X. Capturar imagens tridimensionais z-pilhas. Nota: Existe uma forte EdU sinalizar na tarde-estágio câmaras de ovos e fluorescência de fundo na bainha epitelial. Ao examinar rotulagem EdU em um germário particular, deve-se evitar germariums que são sobrepostos por ou perto de outros tecidos ou câmaras de ovos em fase posterior.

Representative Results

O protocolo acima permite a visualização das estruturas puntiformes associados com mitocôndrias (Figura 1B-C), que indicam a replicação do ADN mitocondrial durante a oogénese Drosophila. O ponto lacrimal EdU localizada com mitocôndrias marcadas por coloração para o ATP sintase subunidade alfa (Figura 2). Os sinais observados foram ausentes nos ovários tratados com brometo de etídio 11, um inibidor de replicação de mtDNA 14, validando que estes pontos lacrimais fato etiqueta replicar mtDNA.Aphidicolin foi usada para inibir a coloração do ADN nuclear, sem afectar a replicação do mtDNA (Figura 2). Sem tratamento afidicolina, sinais Edu intensas rotular os núcleos, e mtDNA puncta quase não foram detectados (Figura 3). No entanto, na presença de afidicolina, a incorporação nuclear foi dramaticamente reduzida e foram observados diversos pontos lacrimais associadas com mitocôndrias. <p class = "jove_content" fo: manter-together.within-page = "1"> Há um alto nível de replicação mtDNA em câmaras de ovos de pós-germário (Figura 1B). No entanto, nomeadamente, a replicação do mtDNA exibido um padrão espacial na germário. Como indicado pelo número de pontos lacrimais EdU, há um nível moderado de replicação mtDNA na região 1 do germário, mas quase sem incorporação EDU nas 2A região (Figura 1C). Como o cisto se move para baixo para 2B região na germário, a replicação é retomada mtDNA e o número de pontos lacrimais EdU no quisto posterior da região 2B foi muito maior do que na região 2A (Figura 1C). Especificamente, a incorporação intensiva EdU foi concentrada em torno dos canais de anel e as estruturas fusoma, como manchado pela hu li tai Shao (HTS) proteína. mtDNA mantidos replicando a um nível elevado na região 3 do germário (Figura 1C) Para demonstrar a associação de especigenes ou tratamento com proliferação mtDNA ic, ovários de Drosophila podem ser submetidos a manipulação genética ou tratamento da toxicodependência. Foram tratados ovários com diferentes concentrações de FCCP, um protonophore mitocondrial clássico, que dissipa o potencial de membrana mitocondrial. Como um controlo, DMSO não tinha efeito na replicação do DNA mitocondrial (Figura 4A). Altas doses de FCCP (10 uM) quase esgotada replicação mtDNA inteiramente todo o germário (Figura 4D). No entanto, menor concentração de FCCP (2 ou 5 uM) teve um impacto menor na replicação do mtDNA na região 1 mas a replicação inibida em regiões 2B e 3 (Figura 4B-C), sugerindo que as regiões 2B e 3 são mais sensíveis à ruptura mitocondrial, ou eles mantêm cinéticas de replicação mais lentas relativos. Os resultados acima indicaram que a replicação do mtDNA está associada com a actividade mitocondrial. Particularmente, diferentes regiões do germário responderam diferentemente às imp mitocondrialairment. Figura 1. replicação mtDNA durante Drosophila oogenesis. (A) Diagrama de um ovaríolo Drosophila e uma visão ampliada da germário. O ovaríolo ilustra da esquerda para a direita, anterior para posterior, estádios de desenvolvimento sucessivos de câmaras de ovos. No germário, o fusoma (vermelho), células-tronco germinativas (azul), mitocôndrias (verdes), oócitos futuro (linha tracejada, reconhecido pelo posicionamento, estrutura fusoma e grupamentos mitocondriais), desenvolvimento de cistos (pêssego) e quatro regiões de desenvolvimento são apresentados . (B) z-projecção pilha representativas de um ovaríolo de tipo selvagem marcado por EDU e o anticorpo contra HTS-RC, um marcador para canais circulares e fusoma. Na presença de afidicolina, a EdU foi incorporado no mtDNA (pontas de setas) e núcleos (setas). Barra de escala, 10 | im.(C) vista ampliada de germaria descritas na região encaixotado B. As quatro regiões de desenvolvimento são indicados. Barra de escala, 5 m 11. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2. replicação mtDNA na germário Drosophila visualizados por incorporação EdU com o tratamento afidicolina (A) -. Seção confocal representante de um germário tipo selvagem mostrando EdU incorporação (D) (verde, b), mitocôndrias, marcada pela ATP sintase subunidade alfa coloração (vermelho, C), e os núcleos, marcado com coloração DAPI (azul, D) com pré-incubação com afidicolina inibidor de ADN polimerase-α. (A &# ;-D 39 ') Uma imagem ampliada da área de box em (A) mostrando EdU incorporação (B'), mitocôndria (C ') e núcleos (D'). Na presença de afidicolina, a incorporação nuclear (setas) é reduzido e muitos pontos lacrimais estavam localizados dentro da mitocôndria (pontas de seta). As barras de escala, 10 | im. A figura foi modificada a partir de 11. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3. replicação mtDNA quase não é detectado no germário Drosophila sem tratamento afidicolina (A) – (D). Seção confocal representante de um germário tipo selvagem mostrando EdU incorporação (verde), mitocôndrias, marcado porATP sintase coloração subunidade alfa (vermelho), e núcleos, marcado com coloração DAPI (azul) na ausência do inibidor da afidicolina ADN polimerase-α. 'Uma imagem ampliada da área de box em (A) mostrando EdU incorporação (B (A'-D)'), mitocôndria (C ') e núcleos (D'). Sem afidicolina, etiqueta sinais intensos Edu núcleos (setas), e mtDNA puncta quase não foram detectadas. As barras de escala, 10 | im. A figura foi modificada a partir de 11. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4. mitocondrial desacoplador prejudica a replicação mtDNA. Projectos z-stack representativos mostrando tipo selvagem germário tratado com DMSO(A) ou o desacoplador FCCP mitocondrial em concentrações de 2 uM (B), 5 uM (C), 10 uM (D) durante EdU incorporação. Note-se a marcação auditivos EdU na região 2B tratada com 2 uM FCCP (B), e em ambos 2B região 3 e tratou-se com 5 uM FCCP (descrito em caixas). Quatro regiões de desenvolvimento são mostrados. Flechas, DNA nuclear; pontas de seta, mtDNA. Barra de escala, 10 | im. A figura foi modificada a partir de 11. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

EdU rotulagem é um método novo e eficiente para detectar a síntese de DNA em células em proliferação, o que é baseada na incorporação de coloração e de análogos de nucleósidos em ADN recém-sintetizado. Este método é superior para o método de marcação com BrdU na medida em que é mais rápido e altamente sensível. Mais importante, ele permite uma boa preservação estrutural e eficiente penetração EDU-corante de tecidos conjunto de montagem 9, 10. Historicamente, como uma alternativa superior para marcação com BrdU, a rotulagem EdU foi utilizado para estudar a replicação do ADN nuclear durante a fase S do ciclo de célula. A afidicolina é um inibidor de α ADN-polimerase, que é o principal polimerase para a replicação do ADN nuclear em fase S 12 15. replicação mtDNA é realizada por γ ADN-polimerase, que é insensível ao tratamento afidicolina. Assim, o tratamento com afidicolina, antes e durante a incubação EdU inibiu significativamente EdU incorporação no ADN nuclear. Deveria-se notar que a afidicolina possa ser estável durante várias semanas, se apropriadamente armazenada, e a eficácia da afidicolina na inibição da replicação do ADN nuclear foi variável nas nossas mãos. Os ovarioles ou câmaras de ovo com rotulagem DNA nuclear forte devem ser excluídos da análise de novos dados.

replicação mtDNA pode ser facilmente visualizado como pontos lacrimais no citoplasma, que também proporciona uma maneira simples para quantificar o nível de replicação do mtDNA por contagem do número de pontos lacrimais EdU, normalizada para o volume total do citoplasma. software de imagem pode ser aplicado para identificar automaticamente EdU pontos lacrimais em imagens microscópicas, o que é especialmente útil para análises computacionais de grandes conjuntos de dados. No entanto, devem ser tomadas precauções, porque a inibição incompleta da replicação do ADN nuclear pode levar à incorporação EdU em loci distintos no cromossoma e exibir como pontos lacrimais dentro do núcleo. Também, em outros casos, a intensidade de incorporação EdU replicando mtDNA pode ser fraca, enquanto o fundo e ruído pode ser alto. Portanto, os parâmetros individuais para análises automáticas de imagem deve ser cuidadosamente definido. Também é recomendado que as imagens devem ser examinadas com os olhos treinados para se certificar de que adequada puncta EdU são identificados.

Visualização de mtDNA recém-sintetizado durante Drosophila oogenesis oferece uma oportunidade para investigar como a replicação mtDNA é regulado sob condições fisiológicas ou patológicas, realizando o experimento em moscas sujeitas a uma variedade de perturbações farmacológicas ou genéticas. Em um estudo anterior, ensaio de incorporação EdU foi realizado em uma mtDNA mutante Drosophila mt: CoI T300I 11. Além disso, a perturbar o potencial de membrana mitocondrial, ovários foram tratadas com várias concentrações de FCCP desacoplador mitocondrial ou 2,4-dinitrofenol (DNP), antes da incorporação EdU. Dependendo dos fins experimentaise as características de drogas, pode ser adotado diferentes métodos para a entrega eficaz. Para moscas adultas, as drogas podem ser apresentadas como um vapor (por exemplo, etanol e cocaína) 16,17 drogas ou pode ser injectado no abdómen, onde rapidamente difunde-se por todo o corpo 18. A prática mais comum é que as drogas são adicionados ao alimento ou uma mosca / papel de filtro saturado com a droga sacarose. Por exemplo, o inibidor de montagem de microtúbulos, colchicina, foi alimentada para moscas durante 2-3 dias antes da dissecação do ovário 19. Por isso, é importante para avaliar o método de administração de fármaco e escolher as concentrações apropriadas.

Para garantir a imagem de sucesso da replicação do mtDNA em ovários de Drosophila, vários passos críticos devem ser cuidadosamente executado. Acima de tudo, preservar a viabilidade ea saúde dos ovários durante a dissecção e Edu incorporação é essencial (etapas 1 e 2). O meio de Drosophila de Schneider com FBS precisa de ser aquecida até à TAantes de usar. Deve-se minimizar o contato direto entre as câmaras de ovos e ferramentas de dissecação ou pontas de pipeta. Os ovários deve ser imersa a soluções de todos os tempos para evitar a desidratação. O manuseio incorreto dos tecidos podem facilmente levar a desmaiar ou nenhuns sinais fluorescentes. Durante o passo de montagem do tecido, ovarioles devem ser separados uns dos outros e espalhar-se sobre a lâmina de microscópio. Certifique-se as câmaras de ovos não são empilhados em cima uns dos outros. Notamos que as câmaras de ovos para além fase 14 demonstrou pouca incorporação EdU. Além disso, por causa do tamanho grande, as câmaras de ovos fase tardia, muitas vezes fazer com que os vizinhos câmaras de ovos mais jovens a ficar fora de foco. Assim, recomenda-se que as câmaras de fase final de ovo ser descartado.

Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a rotulagem replicar mtDNA nos ovários adultos Drosophila. Este método permite a simples quantificação de replicação mtDNA sob várias perturbações genéticas e farmacológicas,e será útil para dissecar os mecanismos subjacentes biogênese mitocondrial desenvolvimento e herança mtDNA.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank K. Delaney for comments on the manuscript. This work was supported by the National, Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) Intramural Program.

Materials

Schneider’s Drosophila medium Invitrogen 21720-024
FBS Invitrogen 10100-147
Pair of Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20
Aphidicolin Sigma A0781 Aliquot after dissolving in DMSO. Avoid repetitive thawing and freezing. Protect from light. May be used within 6 weeks after dissolving. 
FCCP Sigma C2920
DMSO Sigma D2650
Paraformaldehyde, 16% EM grade Electron Microscopy Sciences 15710 Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood with skin and eye protection.
PBS KD Medical RGF-3190
BSA Sigma A7030
Triton X-100 Sigma T9284
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit Invitrogen C10337 EdU, CuSO4, Alexa Fluor 488 azide, EdU reaction buffer and Edu buffer additive are included
Mouse ATP synthase subunit α antibody, (15H4C4) MitoSciences Ab14748 1:1000 dilution
Mouse Hts antibody (clone RC) Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) hts RC 1:1000 dilution
Goat anti-mouse Alexa Fluor 568 secondary antibody Invitrogen A-11004 1:200 dilution
Vectashield mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1500
Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-541-B
Microscope slide Fisher Scientific 22-038-103
Nail polish Elf Many of the pigments used in nail polishes are fluorescent and leach into specimens. Only clear nail polish should be used.
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Referências

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Chen, Z., Xu, H. In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining. J. Vis. Exp. (116), e54516, doi:10.3791/54516 (2016).
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