Summary

熱ショック2処理とゼブラフィッシュ胚の倍数性マニピュレーション

Published: December 16, 2016
doi:

Summary

倍数性操作のための修正されたプロトコルは、初期胚に細胞質分裂における1サイクルのストールを誘導するために熱ショックを使用しています。このプロトコルは、ゼブラフィッシュで実証されているが、他の種にも適用可能です。

Abstract

倍数性の操作は、このような二倍体に四倍に二倍体、または半数体として有用な変換を可能にします。それは、単一のヘテロ接合母親からホモ接合体の直接的な生産を可能にするため、ゼブラフィッシュゼブラフィッシュでは、具体的にホモ接合雌性発生二倍体の生成は、遺伝子解析に有用です。この記事では、まず、細胞周期、熱ショック2(HS2)中の熱パルスに基づいて、倍数性の複製のための修正されたプロトコルについて説明します。中心小体の複製の阻害を介して、この方法は、第2の細胞周期の間に正確な細胞分裂停止をもたらします。影響を受けていないDNAの複製に結合された正確な1サイクルの分割ストールは、全ゲノム重複が生じます。この方法に関連したプロトコルは、1細胞周期の分裂遅延と倍数性の重複を引き起こすために体外受精や熱パルス 、卵と精子コレクション、精子のUV処理が含まれます。このプロトコルの修正バージョンを適用することができます他の動物種における倍数性変化を誘導します。

Introduction

このプロトコルは、雌性発生半数体( 図1)または四倍の生産からホモ接合雌性発生二倍体の世代のようにゼブラフィッシュ胚における倍数性の操作を可能にします。これは、正確に1つの細胞周期( 2A、2B)に対応する細胞質分裂の遅延を誘導することによって達成されます。細胞質分裂において重要な1サイクルの遅延がヒートショックで処理することにより達成されます。もともとStreisingerらによって記載されるように熱ショック(HS)の標準プロトコルは、最初の細胞周期1の間に1サイクル細胞分裂停止を生じ、期間13-15 MPF時の温度パルスを含みました。このプロトコルの効率は、最近、熱ショック処理のスライディング時間窓を用いて初期の細胞周期をスキャンすることによって改善されています。このスキャンは、まだ最初の細胞周期(22-24 MPF)内で、熱ショックのための後の時点を同定し、そのEMBRの高いレートでの結果この場合、第2の細胞周期2に影響与える1サイクル細胞分裂停止とYOS。最初の細胞周期中の実験操作は、第二の細胞周期の間に細胞分裂を妨害し、DNAにコンテンツの複製を引き起こす観察は、他の魚種3,4に報告されています。用語「2」熱パルスが標準HS法よりも後の時点で発生すること、およびHS2によって引き起こされる細胞周期の遅延は、第二の細胞周期の間に発生することを反映する – 私たちは、熱ショック2(HS2、この修正されたプロトコルを参照します)。これらの研究は、熱ショック後に細胞質分裂停止のための基礎は、以下の細胞周期における紡錘体形成および溝誘導に影響を与える熱パルス、中中心小体複製の阻害であることが示されました。 HS2の100%に近づいて細胞周期停止の収量の結果、および標準HS 2の4倍の倍数性複製アップの速度。

胚扱わウィットHA割球の細胞周期の間の熱ショックは、熱ショックが細胞分裂2に必要な複数のプロセスに影響を与えることを示唆し、多くの有害な効果を示します。熱ショックは、細胞周期(期間0~30 MPF)の開始前に印加された場合に、中心小体の複製を有する特定の干渉と一致効果を有することが表示され、他の必須の細胞プロセス2に影響与えていないよう。これらの研究は、前割球の分裂の開始までの時間は、具体的に中心小体阻害を介して倍数性を操作するためのツールとして、熱ショックを使用して、影響を受けやすい発育期間であるように思われることを示しました。中心小体複製の熱ショックの見かけの選択性の根底にある原因は不明であるが、白血球5などの特定の細胞型において熱応力下で観察中心体サブ構造の選択的分解に関連し得ます。

胚ドの時間同期velopmentは、体外受精(IVF)によって達成されます。 HS2に誘導される1サイクル分裂ストール時に四倍になる二倍体胚における受精の結果の間に未処理の精子の使用。そのDNAを不活性化架橋、1サイクルの細胞質分裂のストールは雌性発生二倍体2となっHSIIによって誘発される時に雌性発生半数体胚6、中に結果を運ぶUV処理精子の使用。そのため、得られた全ゲノム重複の、後者の雌性発生二倍体は、ゲノム全体のすべての単一の遺伝子座でホモ接合性です。簡潔にするために、我々は「半数体」、および「ホモ接合二倍体」としてのホモ接合雌性発生二倍体胚として一倍体胚を雌性発生を参照してください。実行可能な肥沃な場合は、ホモ接合二倍体は、滅菌および致死性のない行を開始するために使用することができます。 HS2により誘発される直接的なホモ接合も容易にMUTのヘテロ接合キャリアである雌からホモ接合二倍体以来、遺伝子解析や遺伝子スクリーニングに組み込まれるべきです高い固定でのホモ接合性のations展示率(50%)比2。

以下のプロトコルは、HS2を実行し、完全なホモ接合性と倍数性の重複を誘導する手順を説明します。四倍体製造のために、精子の解決策は、未処理でなければなりません。ホモ接合二倍体を製造するために、精子は、UV処理により不活性化されるべきです。また、議論で説明したように、目に見える色素マーカーはまたホモ接合二倍体の識別を容易にするために使用することができます。最良の結果を得るためIVF手順はこの期間内に発生する必要がありますので、主に光のサイクル7、および両方の大人と卵の開始の最初の3時間の間にゼブラフィッシュの仲間は、概日リズム8に敏感です。

Protocol

マディソン・機関動物実験委員会(IACUC)ガイドライン(ウィスコンシン大学 – – マディソン保証番号A3368-01)全ての動物実験は、ウィスコンシン大学に従って行いました。 1.中断交配を経て卵コレクションのための女性の選択注:IVFベースのプロトコルは、手動圧力〜9人の女性からの成熟卵の押し出しに依存しています。前のプロトコルは、卵の放出挙動を受け、女性ず?…

Representative Results

一細胞周期の分裂の停止にもかかわらず、DNA複製は、胚( 図1)のDNA含量の複製をもたらす、そのような胚において通常起こります。 Streisinger熱ショックプロトコル(標準HS)は、期間13から15分のポスト受精(MPF)の間に熱パルスを伴い、派生方法は、ここで説明したのに対し、35 MPF 1,2において第1胚細胞分裂の際に、主に細胞質分裂停止を誘導?…

Discussion

重要なステップ

体外受精のに有効な条件下で動作することが重要です。成熟卵(ステップ1)の十分な供給を保証するために、交配用に設定雌は、少なくとも5日間交配交配に設定されているべきではないと妊娠を表示されます。繁殖の中断の間に、観察者は自然卵の押し出しの最初の出現のために十分15-30タンクを監視することができます。最初の卵は自然交配を通じてリ?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by NIH grants R21 HD068949-01 and RO1 GM065303.

Materials

Zebrafish mating boxes Aqua Schwarz SpawningBox1
NaCl Sigma S5886
KCl Sigma P5405
Na2HPO4 Sigma S3264
KH2PO4 Sigma P9791
CaCl2 Sigma C7902
MgSO4-7H2O Sigma 63138
NaHCO3 Sigma S5761
Tricaine Western Chemical Tricaine-D (MS 222) FDA approved (ANADA 200-226)
Tris base Sigma 77-86-1 to prepare 1 M Tris pH 9.0
HCl Sigma 920-1 to prepare 1 M Tris pH 9.0
Fish net (fine mesh) (4-5 in) PennPlax (ThatFishThatPlace # 212370) available in ThatFishThatPlace
Plastic spoon available in most standard stores
Dissecting scissors Fine Science Tools 14091-09
Dissecting forceps Dumont SS available from Fine Science Tools
Dissecting stereoscope (with transmitted light source) Nikon SMZ645 or equivalent
Reflective light source (LED arms) Fostec KL1600 LED or equivalent
Petri plates 10 cm diameter any maker
Eppendorf tubes 1.5 ml any maker
Ice bucket any maker
Pipetteman P-1000 any maker
Pipette tips 1000 µl any maker
Narrow spatula Fisher 14-374
Depression glass plate Corning Inc 722085 (Fisher cat. No 13-748B) available from Fisher Scientific
UV lamp UVP Model XX-15 (cat No. UVP18006201) available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting)
UV glasses any maker
Paper towels any maker
Kimwipes Kimberly-Clark 06-666-11 available from Fisher Scientific
Timer stop watch any maker
Wash bottle Thermo Scientific 24020500 available from Fisher Scientific
Tea strainer available in kitchen stores
beakers, 250 ml (2) Corning Inc. 1000250 available from Fisher Scientific
water bath (2) any maker, with accurary to 0.1 C (e.g. Shel Lab H2O Bath Series)
Hanks’ Solution 1 see above see above 8.0g NaCl, 0.4g KCl in 100ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 2 see above see above 0.358g Anhydrous Na2HPO4, 0.6g KH2PO4 in 100ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 4 see above see above 0.72g CaCl2 in 50ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 5 see above see above 1.23g MgSO4 ∙ 7H2O in 50ml ddH2O. Store at 4°C.
Hank's Premix see above see above add, in the following order: 10.0 ml Solution 1;  1.0 ml Solution 2;  1.0 ml Solution 4;  86.0 ml ddH2O;  1.0 ml Solution 5. Store at 4°C
Hanks’ Solution 6 see above see above 0.33g NaHCO3 in 10ml ddH2O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure.
Hank's Solution (final solution) see above see above Combine 990ul of Hank’s Premix and 10ul of freshly made Solution 6 (NaHCO3 solution)

Referências

  1. Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291, 293-296 (1981).
  2. Heier, J., Takle, K., Hasley, A., Pelegri, F. Ploidy manipulation and induction of alternate clevage patterns through inhibition of centrosome duplication in the early zebrafish embryo. Dev. Dyn. 244, 1300-1312 (2015).
  3. Zhang, X., Onozato, H. Hydrostatic pressure treatment during the first mitosis does not suppress the first cleavage but the second one. Aquaculture. 240, 101-113 (2004).
  4. Zhu, X. P., You, F., Zhang, P. J., Xu, J. H., Sun, W. Effects of hydrostatic pressure on microtubule organization and cell cycle in gynogenetically activated eggs of olive flounder (Paralichthys olivaceus). Theriogenology. 68, 873-881 (2007).
  5. Vertii, A., Zimmerman, W., Ivshina, M., Doxsey, S. Centrosome-intrinsic mechanisms modulate centrosome integrity during fever. Mol. Biol. Cell. 26, 3451-3463 (2015).
  6. Walker, C., Detrich, W. H., Westerfield, M., Zon, L. I. . The zebrafish: Genetics and genomics. Vol. 60 Methods in Cell Biology. , 43-70 (1999).
  7. Blanco-Vives, B., Sánchez-Vázquez, F. J. Synchronisation to light and feeding time of circadian rhythms of spawning and locomotor activity in zebrafish. Physiol. Behav. 98, 268-275 (2009).
  8. Dekens, M. P. S., et al. Light regulates the cell cycle in zebrafish. Curr. Biol. 13, 2051-2057 (2003).
  9. Pelegri, F., Schulte-Merker, S., Detrich, W., Zon, L. I., Westerfield, M. . The Zebrafish: Genetics and Genomics Vol. 60 Methods in Cell Biology. , 1-20 (1999).
  10. Hart, N. H., Becker, K. A., Wolenski, J. S. The sperm entry site during fertilization of the zebrafish egg: localization of actin. Mol. Reprod. Dev. 32, 217-228 (1992).
  11. Tsaadon, A., Eliyahu, E., Shtraizent, N., Shalgi, R. When a sperm meets an egg: block to polyspermy. Mol. Cell. Endocrinol. 252, 107-114 (2006).
  12. Wong, J. L., Wessel, G. M. Defending the zygote: search for the ancestral animal block to polyspermy. Curr. Top. Dev. Biol. 72, 1-151 (2006).
  13. Rappaport, R., Rappaport, B. N. Establishment of cleavage furrows by the mitotic spindle. J. Exp. Zool. 189, 189-196 (1974).
  14. Wühr, M., Tan, E. S., Parker, S. K., Detrich, H. W. I., Mitchinson, T. J. A model for cleavage plane determination in early amphibian and fish embryos. Curr. Biol. 20, 2040-2045 (2010).
  15. Yabe, T., Ge, X., Pelegri, F. The zebrafish maternal-effect gene cellular atoll encodes the centriolar component Sas-6 and defects in its paternal function promote whole genome duplication. Dev. Biol. 312, 44-60 (2007).
  16. Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes Dev. 18, 1527-1532 (2004).
  17. Sakai, N., Burgess, S., Hopkins, N. Delayed in vitro fertilization of zebrafish eggs in Hank’s saline containing bovine serum albumin. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 6, 84-87 (1997).
  18. Roco, A. S., Olmstead, A. W., Degitz, S. J., Amano, T., Zimmerman, L. B., Bullejos, M. Coexistence of Y, W, and Z sex chromosomes in Xenopus tropicalis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112, 4752-4761 (2015).
  19. Streisinger, G., Singer, F., Walker, C., Knauber, D., Dower, N. Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish. Genética. 112, 311-319 (1986).
  20. Dekens, M. P. S., Pelegri, F. J., Maischein, H. -. M., Nüsslein-Volhard, C. The maternal-effect gene futile cycle.is essential for pronuclear congression and mitotic spindle assembly in the zebrafish zygote. Development. 130, 3907-3916 (2003).
  21. Pelegri, F., Mullins, M., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. . Met. Cell Biol. Vol. 104. , 83-120 (2011).

Play Video

Citar este artigo
Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment. J. Vis. Exp. (118), e54492, doi:10.3791/54492 (2016).

View Video