Fusion SNARE-mediata del singolo proteoliposomi con bilayers Tethered supportati in una cella di flusso Microfluidic monitorati da polarizzata microscopia TIRF

Fusione della membrana è un processo biologico universale necessario per il traffico intracellulare di lipidi e proteine, la secrezione, la fecondazione, lo sviluppo, e avvolto entrata del virus in organismi ospiti ^1-3. Per la maggior parte delle reazioni di fusione intracellulare, tra cui il rilascio di ormoni e neurotrasmettitori tramite esocitosi, l'energia per fondere due doppi strati lipidici è fornito dalla formazione di un fascio di quattro elica tra cognate solubile N-ethylmaleimide sensibile proteina recettore attaccamento fattore (militare) proteine, ancorato a la vescicola (v-militare) e la membrana di destinazione (t-SNARE) ^4, rispettivamente. Sinaptica vescicole esocitosi è la reazione di fusione più strettamente regolata e si verifica all'interno di un millisecondo dopo l'arrivo di un potenziale ^1,4,5 azione. Il poro di fusione, la connessione iniziale tra i due comparti di fusione, può sfarfallio aperto e chiuso più volte prima di richiudere o espandere in maniera irreversibile ^5-7. Gli ex risultatinel transitorio, "kiss & run" di fusione, mentre il secondo porta alla piena fusione. I fattori che regolano l'equilibrio tra queste due modalità di fusione e dei meccanismi che regolano pori sfarfallamento non sono ben compresi ^5,8.

proteine ​​SNARE sono necessari per esocitosi; sinaptica fusione delle vescicole è abolita sulla scissione di insidie ​​da neurotossine ^9. Esperimenti di fusione di massa utilizzando piccole vescicole unilamellari (SUV) ha mostrato che SNAREs non solo sono necessari, ma anche sufficiente per guidare membrana fusione ^10. In questo saggio rinfusa, SUV ricostituiti con v-SNARE (v-SUV) sono stati drogato con fosfolipidi fluorescenti (N – (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il) -phosphoethanolamine (NBD-PE) e ( N -. (lissamina rodamina B sulfonil) -phosphoethanolamine (LR-PE) e mescolato con vescicole non etichettati contenenti t-SNARE (t-SUV) Inizialmente la fluorescenza di NBD-PE in V-SUV si spegne da Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET ) a LR-PE. Come laboratorioELED v-SUV fondono con etichettati t-SUV, la densità della superficie fluoroforo nella membrana ora combinato si riduce e il conseguente aumento della fluorescenza NBD-PE riporta la portata di lipidi miscelazione ^10. Come il saggio di massa è facile da configurare e analizzare, è stato ampiamente utilizzato per studiare i meccanismi di SNARE mediata fusione ^10-14. Tuttavia, ha diverse limitazioni, come la bassa sensibilità e risoluzione temporale poveri. Ancora più importante, come una misura insieme, è in media risultati per tutti gli eventi che fanno discriminazione tra attracco e la fusione, così come il rilevamento di intermedi hemifusion difficili.

Negli ultimi dieci anni diversi gruppi, compreso il nostro, hanno sviluppato nuovi metodi per monitorare gli eventi di fusione a singolo livello di vescicole ^15-27. Ha e colleghi hanno utilizzato v-SUV impastoiati su una superficie e monitorato la loro fusione con i libero t-SUV ^18,19. Lipid miscelazione è stata monitorata utilizzando FRET tra una coppia di fluorofori lipidi-bound emletti nel V e t-SUV, rispettivamente, utilizzando la microscopia totale ¹⁸ di riflessione a fluorescenza interna (TIRF). Più tardi, il laboratorio di Brunger utilizzato una singola specie di lipidi-label insieme con un pennarello contenuti per la rilevazione simultanea di lipidi e contenuti miscelazione ^20,28. Sia i lipidi e gli indicatori contenuti sono stati inclusi a concentrazioni elevate, auto-spegnimento; fusione con SUV senza etichetta portato a fluorescenza dequenching ^20,28.

Altri hanno fuso v-SUV di doppi strati planari ricostituiti con t-SNARE ^{15-17,21-27,29.} La geometria planare del target (t-SNARE contenente) imita doppio strato meglio il processo di fusione fisiologica di piccole vescicole molto curve con una membrana piatto al plasma. Il gruppo Steinem impiegato membrane poro-spanning ricostituiti con t-SNARE, sospesi su un substrato di nitruro di silicio poroso e rilevata la fusione con i singoli v-SUV con laser confocale microscopia a scansione di ^23. altri Fusato v-SUV a doppi strati planari ricostituiti con t-SNARE, supportati su un substrato di vetro ^{15-17,21,22,24-27,29.} Il grande vantaggio di utilizzare bistrati supportati (SBLs) è che microscopia TIRF può essere utilizzato per rilevare attracco e fusion eventi con un eccellente rapporto segnale-rumore e senza interferenze da trasporto V-SUV, anche se con microfluidica offre anche la risoluzione single-evento utilizzando standard di campo lontano epifluorescenza ^24.

Una delle principali preoccupazioni è se e come le interazioni substrato-doppio strato incidere supportati qualità doppio strato e il processo di fusione. I primi lavori ha fatto uso di SBLs planari che sono stati direttamente supportati su un substrato di vetro o quarzo ^15-17. Queste SBLs sono state fatte da adsorbimento, di rottura, la diffusione e la fusione delle membrane t-SUV sul substrato. E 'stato ben presto si rese conto, tuttavia, che omettendo una componente chiave t-SNARE, SNAP25, da SBLs preparati in questo modo portato a v-SUV di docking e fusion cinetica indistinguisHable da quelli ottenuti con il completo t-SNARE ^17. Perché SNAP25 è assolutamente necessaria per la fusione in vivo ^30,31, la rilevanza fisiologica di questi primi tentativi è stata messa in discussione. Il gruppo di Tamm ha superato questa sfida utilizzando la formazione di doppio strato controllato meglio supportato ^21. Ha usato la deposizione Langmuir-Blodgett per il libero di proteine ​​prima illustrativo del SBL, seguita dalla fusione di che monostrato con t-SUV ^21. Ciò ha provocato la fusione SNAP25-dipendente.

Per evitare potenziali artefatti associati con un doppio strato supportato direttamente su un substrato di vetro, senza necessità di utilizzare metodi di Langmuir-Blodgett, Karatekin et al. Introdotto un poli idrato (glicole etilenico) morbido cuscino, (PEG) tra il doppio strato e il substrato ^24. Questa modifica ha portato anche in SNAP25-dipendente fusione ^24. Doppi strati imbottiti su uno strato di polimero morbido erano stati conosciuti per meglio conservare transmembranala mobilità e la funzione delle proteine ^​​32, ed erano stati utilizzati negli studi di fusione con i virus ^33. Inoltre, doppi strati PEG sembrano mantenere una certa capacità di auto-guarigione e sono molto robusti ^34,35. Innanzitutto, una frazione di catene lipidiche PEG-linked disponibili in commercio sono inclusi nella membrana t-SUV. Quando queste t-SUV scoppiano e formano un doppio strato planare su un substrato di vetro, una spazzola PEG riguarda sia volantini del doppio strato planare. Perché la formazione planare doppio strato è guidato dalla adesione delle catene PEG circostanti t-SUV sulla superficie di vetro idrofila, liposomi scoppio e la formazione di doppio strato planare sono relativamente insensibili alla composizione lipidica utilizzata. Tuttavia, quando sono compresi grandi quantità di colesterolo, aumentando le proprietà coesive dei SUV, SUV non possono scoppiare spontaneamente. Se questo è il caso, osmotici ioni d'urto o bivalenti possono essere impiegati per aiutare a planare formazione doppio strato ^25.

Come accennato in precedenza, in questa approccio un pennello PEG copre entrambi i lati della planare, bistrato supportato. La spazzola di fronte al canale di flusso microfluidica aiuta a prevenire l'adesione non specifica del v-SUV in arrivo che sono di solito ricoperti da uno strato PEG. La formazione di complessi V- e t-SNARE inizia dalla membrana-distale N-Termini e procede a tappe verso i domini di membrana-prossimale ^36. Per il V-SUV di interagire con il t-SBL, il V- e necessità t-SNARE N-termini a sporgere al di sopra delle spazzole PEG, che sembra essere il caso nelle condizioni del saggio. Altezza spazzola può essere adattato per studiare proteine ​​diverse dalle SNAREs variando la densità di lipidi peghilato e la lunghezza della catena PEG ^37,38. Un altro vantaggio delle spazzole PEG che coprono le superfici prossimali dei doppi strati di fusione è che imitano l'ambiente affollato delle membrane biologiche, che sono ricchi di 30.000-40.000 proteine ​​integrali di membrana per quadrato micron ^39. Proprio come le catene di PEG in questo saggio, la Repustrato proteico lsive copre membrane biologiche deve essere messo da parte per consentire il contatto tra le due doppi strati fosfolipidi per la fusione a verificarsi.

canali di flusso microfluidica sono utilizzati in questo test, in quanto offrono vantaggi unici. In primo luogo, il flusso microfluidica consente più la deposizione uniforme delle t-SUV a diffondersi e si fondono per formare il t-SBL. In secondo luogo, il volume del canale piccolo (<1 ml) minimizza il consumo campione. In terzo luogo, i piccoli volumi necessari consentono l'intero esperimento possa essere condotto sotto flusso costante. Flusso rimuove debolmente, presumibilmente non specifico, aderito v-SUV dal SBL ^16. Mantiene inoltre una densità costante di v-SUV sopra la t-SBL, semplificando l'analisi cinetica ^17. Infine, vescicole attraccate sono facilmente distinguibili da quelli gratuiti effettuate dal flusso ^25. Quarto, diversi canali microfluidici possono essere utilizzati sullo stesso vetrino, ognuna sondando una condizione diversa. Ciò permette il confronto delle condizioni during stesso periodo sperimentale. Un approccio simile è stato utilizzato dal gruppo van Oijen per studiare la fusione tra il virus influenzale e SBLs imbottiti ^33.

In microscopia TIRF, il decadimento esponenziale del campo evanescente (con una costante di decadimento ~ 100 nm) limita eccitazione di fluorescenza a quelle molecole che sono in stretta vicinanza dell'interfaccia di vetro-buffer. Questo minimizza il contributo di molecole fluorescenti che sono più lontani, aumenta il rapporto segnale-rumore, e permette sensibilità singola molecola con tempi di esposizione telaio di 10-40 msec. Il campo evanescente comporta anche un aumento del segnale dopo la fusione: il trasferimento lipidi etichettata SUV nel SBL, si trovano, in media, in un campo di eccitazione più forte. Questo aumento della fluorescenza è più forte per liposomi grandi.

Se la luce polarizzata viene utilizzato per generare il campo evanescente, effetti aggiuntivi contribuiscono a variazioni nella fluorescenza upon transfer di etichette dal SUV nella SBL. Alcuni coloranti lipidi hanno un dipolo di transizione orientato con un angolo medio preferito rispetto al doppio strato in cui sono inserite. Questo crea una differenza nella quantità di fluorescenza emessa da fluorofori quando sono in SUV rispetto al SBL, poiché il fascio polarizzato ecciterà coloranti nei due membrane diverso. Per il primo, il fascio di eccitazione interagirà con dipoli di transizione orientate in tutto il SUV sferica, mentre per il secondo, orientamenti dipolo saranno limitati dalla geometria SBL piatta. Ad esempio, quando si utilizza s-polarizzata luce incidente (polarizzata normale al piano di incidenza), eccitazione è più efficace quando il colorante è nella SBL rispetto al SUV per un colorante lipidi transizione dipolo orientato parallelamente alla membrana ^29,40 (come quella di DII o DID ^41-43). Un SUV drogato con una tale fluoroforo appare scura quando esso si fissa su l'SBL (Figura 7, Representat ive risultati). Come un poro di fusione apre e collega le membrane SUV e SBL, sonde fluorescenti diffondono nel SBL e diventano più probabilità di essere eccitato dal campo evanescente s-polarizzati ^25,27,29. Di conseguenza, il segnale di fluorescenza integrato intorno al sito di fusione aumenta bruscamente durante il trasferimento di colorante dal SUV nella SBL ²⁷ (Figura 3 e Figura 7). Un ulteriore fattore che contribuisce alle variazioni del segnale che accompagnano la fusione è dequenching di etichette fluorescenti come vengono diluiti quando trasferito nella SBL. Il contributo di dequenching è generalmente minore rispetto al campo di decadimento e di polarizzazione effetti evanescenti nel test qui descritto, perché solo una piccola frazione ( ) Dei lipidi sono etichettati.

L'aumento del segnale dopo fusione può essere sfruttata per dedurre proprietà poro di fusione confrontando il tempo,1 "src =" / files / ftp_upload / 54349 / 54349eq2.jpg "/>, richiesto per un lipide di fuggire attraverso un poro che è liberamente permeabile ai lipidi per il tempo di rilascio effettivo, . Se i due scale temporali sono comparabili, sarebbe concludere che il poro presenta poca resistenza al flusso dei lipidi. Tuttavia, se il tempo di rilascio effettivo è notevolmente più lungo del tempo di immissione a diffusione limitata, ciò indica un processo, come pori sfarfallio, ritardando il rilascio dei lipidi. Il tempo di rilascio di diffusione limitata, , Dipende dalle dimensioni del liposoma fusione e lipidi diffusività; la stima richiede questi due parametri da quantificare. Il singolo sensibilità molecola del test permette di lipidi diffusività da misurare, monitorando diversi fluorofori singolo lipidi dopo la loro immissione in SBL per ogni evento di fusione ^26. Le dimensioni di ogni vescicole fusionepuò essere stimato ²⁷ combinando (i) l'intensità di un singolo colorante lipidi, (ii) la variazione di fluorescenza totale circa una docking sito dopo tutti fluorofori sono trasferiti nel SBL sulla fusione, (iii) la nota densità etichettatura dei SUV lipidi, e (iv) la superficie per lipidica. Per molti eventi di fusione, l'attuale tempi di rilascio dei lipidi sono risultati essere molto più lento di quanto previsto dal rilascio diffusione controllato ^27, come è stato notato in precedenza assumendo dimensioni SUV uniforme ^44. Assumendo il ritardo del rilascio di lipidi è dovuta a pori sfarfallio, un modello quantitativo permette di stimare "apertura dei pori", la frazione di tempo poro rimane aperta durante la fusione ^27.

Ogniqualvolta pratica, è importante testare meccanismi di fusione utilizzando sia lipidi e contenuto solubili etichette. Ad esempio, il rilascio dei lipidi potrebbe essere ritardato con metodi diversi da pori tremolante, come la restrizione di lipidi diffusione dalle proteine ​​SNARE che circondano tegli poro. Se così fosse, quindi rilasciare dei contenuti sarebbe precedere supporto di etichette lipidi, purché il poro è sufficientemente grande da consentire il passaggio di sonde solubili. Un difetto più fondamentale in approccio potrebbe essere nella ipotesi che il trasferimento dei lipidi etichettati al SBL avviene attraverso uno stretto poro di fusione collega la SBL ad una vescicola che ha sostanzialmente mantenuto la sua forma pre-fusione. Trasferimento dei lipidi nel SBL potrebbe anche derivare da una rapida dilatazione del poro di fusione con un concomitante, estremamente rapido collasso del SUV nella membrana SBL, come suggerito in precedenza sulla base dei dati di rilascio dei lipidi solo ^29. Monitoraggio sia lipidi e contenuto rilasciare contemporaneamente, si è constatato che molti pori richiuse dopo aver rilasciato tutte le loro etichette di lipidi, ma mantenuto alcune delle loro carico solubile ^27. Questo indica che almeno alcuni liposomi non collassano nel SBL dopo la fusione, e che il trasferimento di colorante dei lipidi nel SBL avviene attraverso un poro di fusione. Inoltre, lIPID e contenuto liberazione è avvenuta contemporaneamente ^27, il che rende improbabile che il ritardo del rilascio di lipidi è dovuto alla impedimento di lipidi diffusione dalle proteine ​​SNARE che circondano il poro ^45.

Un protocollo di fusione SUV-SBL che non monitorare il rilascio contenuti solubili è stato precedentemente pubblicato da Karatekin e Rothman ^25. Qui, gli sviluppi più recenti sono incluse, il monitoraggio e cioè simultaneo di lipidi e contenuti rilascio e la stima delle proprietà SUV, lipidi, e poro di fusione ^27. Il protocollo inizia con le istruzioni per la preparazione delle cellule microfluidica, realizzati da incollaggio un poli (dimetil silossano) (PDMS) elastomero blocco contenente scanalature con un vetrino di vetro ^25. Successivamente, la preparazione di v-SUV con sia lipidi e contenuto marcatori è spiegato. Sezioni 4 e 5 forniscono istruzioni per l'assemblaggio delle celle microfluidica, formando le SBLs in situ e il controllo di difetti e la fluidità, l'introduzione di vSUVS nelle celle di flusso e il rilevamento degli eventi di fusione. Sezione 6 fornisce le istruzioni per l'analisi dei dati.