Fusion SNARE-médiée de Single protéoliposomes avec bicouches supportées Tethered dans une cellule microfluidique débit contrôlé par Polarized FRBR Microscopie

Fusion membranaire est un processus biologique universel requis pour le trafic intracellulaire de lipides et de protéines, la sécrétion, la fertilisation, le développement, et enveloppait entrée du virus dans des organismes hôtes ^1-3. Pour la plupart des réactions de fusion intracellulaire , y compris la libération d'hormones et de neurotransmetteurs par exocytose, l'énergie nécessaire pour faire fondre les deux bicouches lipidiques est assurée par la formation d'un faisceau de quatre hélices entre les récepteurs de la protéine de fixation du facteur apparenté soluble dans le N-éthylmaléimide sensible à des protéines (SNARE), ancrée dans la vésicule (v-SNARE) et la membrane cible (t-SNARE) ^4, respectivement. Synaptic vésiculaire exocytose est la réaction de la fusion la plus étroitement régulée et se produit au sein d' une milliseconde après l'arrivée d'une action ^1,4,5 potentiel. Le pore de fusion, la connexion initiale entre les deux compartiments de fusion, peut scintiller ouvert et fermé à plusieurs reprises avant refermeture ou l' expansion irréversible ^5-7. Les résultats antérieursen transitoire, "kiss & run" fusion, tandis que le second conduit à la pleine fusion. Les facteurs qui régissent l'équilibre entre ces deux modes de fusion et des mécanismes de régulation des pores scintillements ne sont pas bien comprises ^5,8.

protéines SNARE sont nécessaires pour l'exocytose; fusion des vésicules synaptiques est abolie lors du clivage de SNAREs par des neurotoxines ^9. Expériences de fusion en vrac à l' aide de petites vésicules unilamellaires (SUV) ont montré que SNAREs sont non seulement nécessaires, mais aussi suffisante pour entraîner la fusion de la membrane ^10. Dans cet essai en vrac, SUVs reconstitués avec v-SNARE (v-SUV) ont été dopés avec des phospholipides fluorescents (N – (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) -phosphoethanolamine (NBD-PE) et ( N -. (lissamine rhodamine B sulfonyl) -phosphoethanolamine (LR-PE) et on mélange avec des vésicules non marquées contenant du t-SNARE (t-SUV) dans un premier temps la fluorescence du NBD-PE en v-SUV est désactivé par Förster transfert d'énergie par résonance (FRET ) pour LR-PE. En laboratoireELED v-VUS fusionnent avec sans étiquette t-SUV, la densité de surface de fluorophore dans la membrane maintenant combinée est réduite et l'augmentation résultante de NBD-PE fluorescence rapporte l'étendue des lipides de mélange ^10. Comme le test en vrac est facile à configurer et à analyser, il a été largement utilisé pour étudier les mécanismes de SNARE médiée par fusion ^10-14. Cependant, il présente plusieurs limites, telles que la faible sensibilité et une mauvaise résolution temporelle. Plus important encore, en tant que mesure d'ensemble, il est en moyenne des résultats sur tous les événements qui font une discrimination entre l'amarrage et la fusion, ainsi que la détection des intermédiaires difficiles de hemifusion.

Au cours de la dernière décennie , plusieurs groupes, dont le nôtre, ont mis au point de nouveaux tests pour surveiller les événements de fusion au niveau de la vésicule unique ^15-27. Ha et ses collègues ont utilisé v-VUS attachés sur une surface et un suivi de leur fusion avec libres t-VUS ^18,19. Le mélange de lipides a été contrôlée en utilisant le FRET entre une paire de fluorophores lié aux lipides emlits dans le v- et t-SUV, respectivement, en utilisant la fluorescence totale de réflexion interne (FRBR) microscopie ^18. Plus tard, le laboratoire de Brunger utilisé une seule espèce de lipide-étiquette avec un marqueur de contenu pour la détection simultanée des teneurs en lipides et le mélange ^20,28. Tant le lipide et les marqueurs de contenu ont été inclus à des concentrations élevées, auto-extinction; fusion avec VUS non marqués a donné lieu à fluorescence dequenching ^20,28.

D' autres ont fusionné v-VUS à bicouches planes reconstituées avec t-SNAREs ^{15-17,21-27,29.} La géométrie plane de la cible (t-SNARE contenant) bicouches imite mieux le processus de fusion physiologique de petites vésicules, à forte courbure d'une membrane plasmique à plat. Le groupe Steinem utilise des membranes à pores transmembranaires reconstituées avec du t-SNARE, suspendue sur un substrat de nitrure de silicium poreux et détecté la fusion avec v-SUV individuels en utilisant laser microscopie confocale à balayage ^23. f Autresv-VUS d' occasion à bicouches planes reconstituées avec t-SNAREs, pris en charge sur un substrat de verre ^{15-17,21,22,24-27,29.} Le grand avantage de l'utilisation de bicouches pris en charge (SBLS) est que la microscopie TIRF peut être utilisé pour détecter accueil et de fusion des événements avec un excellent rapport signal-bruit et sans interférence de v-VUS libres, bien que l'utilisation microfluidique fournit également la résolution d'événement unique à l'aide champ lointain norme microscopie épifluorescence ^24.

Une préoccupation majeure est de savoir si et comment les interactions substrat-bicouche affectent pris en charge la qualité de bicouche et le processus de fusion. Les premiers travaux a fait usage de LTTS planes qui ont été directement pris en charge sur un verre ou de quartz substrat ^15-17. Ces LTTS ont été faites par adsorption, à l'éclatement d'étalement et de la fusion des membranes du t-SUV sur le substrat. Il a été vite rendu compte, cependant, que l'omission d'un élément clé t-SNARE, SNAP25, de LTTS préparés de cette manière a donné lieu à v-SUV accueil et fusion cinétique indistinguishable de ceux obtenus en utilisant la complète t-SNAREs ^17. Parce que SNAP25 est absolument nécessaire pour la fusion in vivo ^30,31, la pertinence physiologique de ces premières tentatives a été mis en question. Le groupe de Tamm a surmonté ce défi en utilisant mieux contrôlé appuyé la formation de bicouche ^21. Il a utilisé un dépôt de Langmuir-Blodgett , pour la première plaquette exempt de protéines du SBL, suivi par la fusion de cette monocouche avec des T-SUV ^21. Cela a abouti à la fusion SNAP25-dépendante.

Afin d' éviter des artefacts potentiels associés à un bi – couche directement supporté sur un substrat de verre sans qu'il soit nécessaire d'utiliser des méthodes de Langmuir-Blodgett, Karatekin et al. , A présenté un poly hydraté (éthylène glycol) (PEG) amortit entre la double couche et le substrat ^24. Cette modification a aussi entraîné SNAP25 dépendant fusion ^24. Bicouches rembourrées sur une couche de polymère mou avaient été connus pour mieux préserver transmembranairela mobilité de la protéine et de la fonction ^32, et ont été utilisées dans des études de fusion avec ³³ les virus. En outre, les bicouches PEGylés semblent conserver une certaine capacité d'auto-guérison et sont très robustes ^34,35. Tout d'abord, une fraction de disponibles dans le commerce, les chaînes de PEG lipidiques liées sont inclus dans la membrane t-SUV. Lorsque ces T-VUS éclatent et forment une bicouche plane sur un substrat de verre, une brosse PEG couvre les deux feuillets de la bicouche planaire. Comme la formation de bicouches plane est entraînée par adhérence des chaînes de PEG entourant t-SUV sur la surface du verre hydrophile, d'un liposome éclatement et la formation de deux couches planes sont relativement insensibles à la composition lipidique utilisée. Cependant, lorsque de grandes quantités de cholestérol sont inclus, ce qui augmente les propriétés de cohésion des VUS, les VUS ne peuvent pas éclater spontanément. Si tel est le cas, les ions divalents ou choc osmotique peuvent être utilisés pour aider à la formation de deux couches planes ^25.

Comme il est mentionné ci-dessus, dans la présente apapproche une brosse PEG couvre les deux côtés de la plane, soutenue bicouche. La brosse en face du canal d'écoulement microfluidique aide à prévenir l'adhérence non spécifique de v-VUS entrants qui sont aussi généralement recouvertes d'une couche de PEG. Formation de complexes V- et t-SNARE commence à partir de l' extrémité N-terminales et procède à la membrane distale progressivement vers les domaines de la membrane proximale ^36. Pour les v-VUS d'interagir avec le t-SBL, le v- et le besoin t-SNARE N-terminales pour faire saillie au-dessus des brosses PEG, ce qui semble être le cas dans les conditions de l'essai. La hauteur de brosse peut être adapté à l' étude des protéines autres que SNAREs en faisant varier la densité des lipides pégylés et la longueur de la chaîne de PEG ^37,38. Un autre avantage des brosses PEG couvrant les surfaces proximales des bicouches de fusion est qu'ils imitent l'environnement encombré des membranes biologiques qui sont emballés avec 30.000-40.000 protéines membranaires intégrales par micron carré ^39. Tout comme les chaînes de PEG dans cet essai, le repulsive couche de protéines portant sur des membranes biologiques doit être mis de côté pour permettre un contact entre les deux bicouches phospholipidiques pour la fusion se produise.

des canaux d'écoulement fluidiques sont utilisés dans ce test, car ils offrent des avantages uniques. Tout d'abord, le flux microfluidique permet un dépôt plus uniforme de t-VUS à se répandre et fusible pour former le t-SBL. Deuxièmement, le petit volume de canal (<1 pi) minimise la consommation d'échantillon. Troisièmement, les petits volumes requis permettent à l'ensemble de l'expérience effectuée en vertu du débit constant. Débit supprime faiblement, probablement non spécifique, adhéré v-VUS de la SBL ^16. Il maintient également une densité constante de v-VUS au- dessus du t-SBL, ce qui simplifie l' analyse cinétique ^17. Enfin, les vésicules accostés se distinguent facilement de celles qui sont libres portés par le flux ^25. Quatrièmement, plusieurs canaux microfluidiques peuvent être utilisés sur le même lamelle, sonder chacun un état différent. Ceci permet la comparaison des conditions during le même essai expérimental. Une approche similaire a été utilisée par le groupe van Oijen pour étudier la fusion entre le virus de la grippe et LTTS rembourrées ^33.

En microscopie TIRF, la décroissance exponentielle du champ évanescent (avec une constante de désintégration ~ 100 nm) confine l'excitation de fluorescence à ces molécules qui sont très près de l'interface verre-tampon. Cela réduit la contribution des molécules fluorescentes qui sont plus loin, augmente le rapport signal-bruit, et permet une sensibilité molécule unique avec des temps d'exposition de vues de 10-40 msec. Le champ évanescent conduit également à une augmentation du signal lors de la fusion: le transfert marqué des lipides du SUV dans la SBL, ils se trouvent, en moyenne, dans un champ d'excitation plus forte. Cette augmentation de la fluorescence est plus forte pour les grands liposomes.

Si la lumière polarisée est utilisée pour générer le champ évanescent, d'autres effets contribuent à des changements de fluorescence lors de la transfert des étiquettes du SUV dans la SBL. Certains colorants lipidiques ont un dipôle de transition orienté avec un angle moyen préféré par rapport à la double couche dans laquelle elles sont incorporées. Cela crée une différence dans la quantité de fluorescence émise par les fluorophores quand ils sont dans le SUV par rapport à la SBL, étant donné que le faisceau polarisé excitera les colorants dans les deux membranes différentes. Pour les premiers, le faisceau d'excitation va interagir avec dipôles de transition orientés autour du SUV sphérique, alors que pour ce dernier, les orientations dipolaires seront limitées par la géométrie SBL plat. Par exemple, quand on utilise de lumière polarisée incidente (polarisation perpendiculaire au plan d'incidence), l' excitation est plus efficace lorsque le colorant est dans la SBL que dans le SUV à un lipide colorant transition dipôle orienté parallèlement à la membrane ^29,40 (comme celui de Dil ou DiD ^41-43). Un SUV dopé avec un tel fluorophore apparaît dim quand il docks sur la SBL (Figure 7, représentat ive résultats). Comme un pore de fusion ouvre et relie les membranes de SUV et SBL, les sondes fluorescentes diffusent dans la SBL et deviennent plus susceptibles d'être excités par le champ évanescent ^25,27,29 polarisée s. Par conséquent, le signal de fluorescence intégrée autour du site de fusion augmente fortement au cours du transfert de colorant depuis le SUV dans la (figure 7 et figure 3) SBL ^27. Un autre facteur qui contribue à signaler des changements qui l'accompagnent fusion est dequenching de marqueurs fluorescents tels qu'ils sont dilués lorsqu'ils sont transférés dans le SBL. La contribution de dequenching est généralement mineure par rapport aux effets évanescents de décroissance du champ et de polarisation dans l'essai décrit ici, car seule une petite fraction ( ) Des lipides sont marqués.

L'augmentation du signal lors de la fusion peut être exploitée pour déduire des propriétés de fusion des pores en comparant le temps,1 "src =" / files / ftp_upload / 54349 / 54349eq2.jpg "/>, requis pour un lipide pour échapper à travers un pore qui est librement perméable aux lipides à l'instant réel de libération, . Si les deux échelles de temps sont comparables, on en conclut que le pore présente une faible résistance à l'écoulement des lipides. Toutefois, si le temps de libération réelle est beaucoup plus longue que le temps pour la libération de diffusion limitée, cela indiquerait un processus, tels que les pores vacillement, retardant la libération des lipides. Le temps de libération limitée par diffusion, , Dépend de la taille du liposome de fusion et de lipides diffusivité; son estimation exige que ces deux paramètres à quantifier. La sensibilité seule molécule de l'essai permet lipidique diffusivité à mesurer au moyen de plusieurs fluorophores unique de lipides après leur libération dans la SBL pour chaque événement de fusion ^26. La taille de chaque vésicule fusionpeut être estimée ²⁷ en combinant : (i) l'intensité d'un colorant unique de lipides, (ii) la modification de la fluorescence totale autour d' un site d'accueil après que tous les fluorophores sont transférés dans la SBL lors de la fusion, (iii) la densité de marquage connu de SUV les lipides, et (iv) la surface par lipide. Pour de nombreux événements de fusion, les temps des lipides de libération réels se sont révélés être beaucoup plus lent que prévu par la diffusion à libération contrôlée ^27, comme cela a été indiqué précédemment en supposant que la taille de SUV uniforme ^44. En supposant un retard de lipide libération est due à des pores de scintillement, un modèle quantitatif permet d' estimer « l' ouverture des pores", la fraction du temps le pore reste ouvert pendant la fusion ^27.

À chaque fois que possible, il est important de tester les mécanismes de fusion en utilisant à la fois solubles dans les lipides et les contenus des étiquettes. Par exemple, le lipide libération pourrait être retardée par des procédés autres que le scintillement des pores, telles que la restriction de la diffusion des lipides par les protéines SNARE qui entourent til pore. Si tel était le cas, alors la libération de contenus précéderait libération des étiquettes lipidiques, à condition que le pore est assez grand pour permettre le passage de sondes solubles. Une faille plus fondamentale dans l'approche pourrait être dans l'hypothèse que le transfert des lipides marqués à la SBL se produit à travers une fusion étroite pores reliant la SBL à une vésicule qui a conservé en grande partie sa forme pré-fusion. Transfert de Lipid dans le SBL pourrait également résulter de la dilatation rapide du pore de fusion avec une concomitante, extrêmement rapide effondrement du SUV dans la membrane SBL, comme précédemment suggéré sur la base de données des lipides de libération seuls ^29. Contrôler à la fois des lipides et le contenu de libérer en même temps, on a constaté que de nombreux pores refermés après libération de leurs marqueurs de lipides, mais a conservé une partie de leur cargaison soluble ^27. Ceci indique qu'au moins certains des liposomes ne fusionnent pas dans la SBL après la fusion, et que le transfert des lipides de colorant dans le SBL se produit à travers un pore de fusion. En outre, lipid et le contenu de presse a eu lieu simultanément ^27, ce qui rend peu probable que le retard de lipide libération était due à l' entrave de la diffusion des lipides par les protéines SNARE entourant le pore ^45.

Un protocole de fusion SUV-SBL qui ne surveille pas le contenu soluble communiqué a été publié par Karatekin et Rothman ^25. Ici, des développements plus récents sont inclus, la surveillance soit simultanée des teneurs en lipides et libèrent et l' estimation des propriétés SUV, lipides, et la fusion des pores ^27. Le protocole commence avec des instructions pour la préparation des cellules microfluidiques, réalisés par collage d' un poly (diméthylsiloxane) , des rainures (PDMS) élastomère à blocs contenant une lamelle de verre ^25. Ensuite, la préparation de v-SUV à la fois avec les lipides et le contenu des marqueurs est expliqué. Les articles 4 et 5 fournissent des instructions pour l' assemblage des cellules microfluidiques, formant les LTTS in situ et la vérification des défauts et la fluidité, l' introduction de vSUVS dans les cellules d'écoulement et la détection d'événements de fusion. Section 6 fournit des instructions pour l'analyse des données.