السلوكيات حاسة الشم يعاير التي تتبع الكمبيوتر<em> ذبابة الفاكهة</em> في Olfactometer أربعة رباعي
Summary
We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.
Abstract
ويكمن التحدي الرئيسي في بيولوجيا الأعصاب هو فهم كيف الدوائر العصبية تعمل لتوجيه سلوكيات الحيوان المناسبة. ذبابة الفاكهة هو نظام نموذجا ممتازا لمثل هذه التحقيقات بسبب سلوكياتها معقدة، تقنيات وراثية قوية، والجهاز العصبي المضغوط. وقد استخدمت مختبر فحوصات السلوكية طويلة مع ذبابة الفاكهة لمحاكاة خصائص البيئة الطبيعية ودراسة الآليات العصبية الكامنة وراء السلوكيات المقابلة (على سبيل المثال انجذاب ضوئي، الكيميائي، والتعلم الحسية والذاكرة) 1-3. مع توافر الأخيرة من مجموعات كبيرة من خطوط ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا أن تسمية مجموعات فرعية العصبية محددة، وقد اتخذت المقايسات السلوكية على الدور البارز لربط الخلايا العصبية مع السلوكيات 4-11. نماذج متعددة وقابلة للتكرار، جنبا إلى جنب مع إجراءات الحسابية الأساسية لتحليل البيانات، لا غنى عنها لاختبارات سريعة لخطوط الطيران مرشح مع مختلف genotypوفاق. ولا سيما مفيدة هي الاجهزة التي تتسم بالمرونة في عدد الحيوانات المختبرة، ومدة التجارب وطبيعة المحفزات المقدمة. يجب فحص الاختيار أيضا توليد البيانات استنساخه التي هي سهلة للحصول على وتحليلها. هنا، نقدم وصفا مفصلا للنظام وبروتوكول لمعايرة الاستجابات السلوكية ذبابة الفاكهة الذباب في الساحة أربعة ميدانية كبيرة. يستخدم الإعداد هنا لفحص ردود الذباب لحافز الشم واحد؛ ومع ذلك، قد يتم تعديل نفس الإعداد لاختبار حاسة الشم متعددة، والمحفزات البصرية أو علم البصريات الوراثي، أو مزيج من هذه. الإعداد olfactometer يسجل النشاط السكان ذبابة الرد على الروائح، وتطبق الأساليب التحليلية الحسابية لتحديد السلوكيات الطاير. ويتم تحليل البيانات التي تم جمعها للحصول على قراءة سريعة التدريجي من شوط التجريبية، وهو أمر ضروري لجمع البيانات بكفاءة والاستفادة المثلى من الظروف التجريبية.
Introduction
القدرة على التكيف والاستجابة للبيئة الخارجية هو أمر حاسم لبقاء جميع الحيوانات. يحتاج الحيوان إلى تجنب المخاطر، والسعي إلى الطعام وتجد زملائه، والتعلم من التجارب السابقة. تعمل أنظمة حسية لاستقبال مجموعة متنوعة من المحفزات، مثل البصرية والكيميائية وميكانيكية حسية، وترسل هذه الإشارات إلى الجهاز العصبي المركزي إلى أن تفسر وفك الشفرة. الدماغ ثم يوجه السلوكيات الحركية المناسبة تبعا لبيئة ينظر إليها، مثل بحثا عن الغذاء أو الهروب من الحيوانات المفترسة. فهم كيفية الكشف عن أنظمة حسية العالم الخارجي، وكيف يترجم المخ ويوجه القرارات، تحديا كبيرا في علم الأعصاب.
ذبابة الفاكهة هو نظام نموذج قوي للتحقيق في كيفية العصبية السلوكيات الدوائر دليل. وبالإضافة إلى كونها بسيطة وغير مكلفة للحفاظ على، ذبابة الفاكهة المعرض العديد من السلوكيات المتنوعة والمعقدة النمطية، ولكن القيام بذلك مع COMPACر الجهاز العصبي من حوالي 100،000 الخلايا العصبية. وتوجد تقنيات وراثية قوية لمعالجة جينوم ذبابة الفاكهة، والآلاف من خطوط المعدلة وراثيا قد تولدت أن تسمية انتقائي وبتكاثر نفس مجموعات فرعية من الخلايا العصبية 10-13. هذه خطوط المعدلة وراثيا يمكن أن تستخدم للتلاعب بشكل انتقائي على نشاط الخلايا العصبية المسماة (تنشيط أو تثبيط)، وهذه المعالجات يمكن استخدامها للتحقق من مدى العصبية السلوكيات وظائف دليل.
وقد وضعت المقايسات سلوكية متعددة لدراسة مختلف السلوكيات ذبابة الفاكهة. ذبابة الفاكهة، مثل العديد من الحيوانات، واستخدام حاسة الشم لتوجيه العديد من الخيارات السلوكية، مثل إيجاد الغذاء، وإيجاد الاصحاب، وتجنب المخاطر. لذا الشم هو نظام الحسي جيد للتحقيق في كيفية الكشف عن المؤثرات الخارجية وتفسيرها من قبل الجهاز العصبي للحيوان لتوجيه الخيارات المناسبة. على هذا النحو، وقد وضعت عددا من المقايسات لinvestigaتينغ اليرقات والسلوكيات حاسة الشم الكبار. تقليديا، كانت يعاير السلوكيات حاسة الشم في ذبابة الفاكهة عن طريق الاختيار اثنين النموذج T-متاهة، والتي يمكن أن تستخدم لمعايرة الفطرية وتعلم السلوكيات حاسة الشم 3. في هذا الاختبار، يتم منح حوالي 50 الذباب الاختيار بين اثنين من أنابيب: أنبوب واحد يحتوي على رائحة في مسألة والآخر يحتوي على الرائحة التحكم (عادة المذيب رائحة). وترد الذباب فترة معينة من الوقت لاتخاذ خيار، ثم عدد من الذباب التي هي في غرف مختلفة تحسب. على الرغم من أن T-متاهة هو فحص بسيط للعديد من التجارب، وهناك العديد من القيود. على سبيل المثال، يتم قياس السلوكيات حاسة الشم عند نقطة مرة واحدة فقط، ويتم التخلص منها خيارات مختلفة ألقاه أمام هذه نقطة زمنية. وبالمثل، فإن إهمال السلوكيات الفردية من الذباب في أوساط السكان. بالإضافة إلى ذلك، T-متاهة يتطلب العد والفرز اليدوي من الذباب، والتي قد إدخال أخطاء. وأخيرا، لأن هناك خيارين فقط مدروسة، وهذايقلل من القدرة الإحصائية في كثير من الأحيان المطلوبة للكشف عن التغيرات السلوكية خفية. بديل للاختيار من اثنين T-متاهة هو أربعة رباعي (أربعة الحقل) olfactometer 14-18. في هذا الاختبار، والحيوانات استكشاف الساحة التي شغل في كل من الزوايا الأربع من الساحة مع مصدرا محتملا للهواء odorized. الساحة ديها شكل نجمة مجعد لتحقيق أقصى قدر من تشكيل أربعة أجزاء رائحة محددة تجريبيا. إذا تم توفير رائحة في واحدة من زوايا ثم يرد عليه فقط في هذا الربع واحد. يمكن تتبع سلوكيات الحيوانات لأنها تدخل وترك الربع رائحة، وبسهولة مقارنة سلوكهم في الأرباع الثلاث لمراقبة. وبالتالي olfactometer فحص أربعة رباعي السجلات استجابة سلوكية المكانية والزمانية للمنبهات رائحة على الساحة التجريبية كبيرة.
تم تطوير olfactometer أربعة رباعي أول مرة من قبل بيترسون وآخرون. 15 والطبيب البيطري وآخرون. 17 للتحقيق في رأالاستجابات السلوكية مصنع من غشائيات الأجنحة الطفيلية الفردية. Faucher وآخرون. 18 وSemmelhack وانغ 16 تكييفها الإعداد لرصد ردود حاسة الشم الفردية ذبابة الفاكهة. وolfactometer أربعة رباعي حساسة بالتساوي على الردود جذابة ومثيرة للاشمئزاز، والسماح لمجموعة واسعة من عطر اختبار والشروط. تتبع البرامج الطيران العرف مكتوب، التي وضعتها أليكس Katsov 19 ويحتفظ بها حاليا من قبل جوليان براون (المفصل في المواد)، قدم مزايا إضافية لمزيد من تطبيقات الأخيرة من olfactometer أربعة رباعي 14،20-23. أصبح من الممكن الآن لفحص ما يصل الى 100 الذباب في وقت واحد في مكانية عالية (27.5 بكسل / سم) والزمنية (30 لقطة في الثانية) القرار الذي يسمح استخراج معايير مختلفة، مثل موقف والسرعة والتسارع من الذباب في أي نقطة زمنية. وهذا يتيح التحقيقات في ديناميات الاستجابات السلوكية الذباب "لالروائح 20 </sتصل>. وتجدر الإشارة إلى أنه، مع ذلك، أن هوية الذباب الفردية ضمن السكان خلال الفترة تتبع كامل لم يتم المحافظة. بدلا من ذلك، يتم تسجيل كل مسار الطيران لطالما مسارين ذبابة لا تتقاطع. وعند هذه النقطة، يتم تعيين مسارات جديدة بعد تتباعد الذباب. من خلال دمج البرامج الأخرى التقاط الفيديو (المفصلة في الجدول المواد)، وهو نفس التكوين يسمح فترات تتبع مرنة ويمكن استخدامها لتتبع الذباب لمدة تصل إلى 24 ساعة من التقاط الصور في انخفاض معدل الإطار. وقد استخدم هذا الخيار لدراسة السلوكيات وضع البيض من الذباب ومقارنة أوضاع الجسم مع تفضيلات ovipositional 14. ويمكن أيضا أن تستخدم olfactometer أربعة المجال لدراسة الردود على المتعدد الوسائط (مثل حاسة الشم والبصرية) المحفزات، أو الجمع بين علم البصريات الوراثي 9 أو توليد الحرارة 21 التحفيز مع العروض من المحفزات الحسية. وعلاوة على ذلك، يسمح القرار زمنية عالية استخراج مسارات FOص كل ذبابة الفردية في مجموعة البيانات الفرقة. وبالتالي، يسمح للطريقة التحقيق في سلوك السكان حاسة الشم الموجهة، وكذلك التفاعلات الاجتماعية الفردية. البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة هذا الاختبار هي قوية وقابلة للتكرار للغاية، مما يسمح للاستخدام olfactometer أربعة الميداني للشاشات السلوكية.
نحن هنا وصف التجمع الإعداد لolfactometer أربعة رباعي. علينا مواصلة التظاهر استخدامها في معايرة جذب حاسة الشم ردا على خل التفاح والتنافر ردا على بروبيونات إيثيل عالية التركيز. وأخيرا، نحن تصف وتوفير رمز المثال لتحليل البيانات تتبع الطيران المسجلة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وolfactometer أربعة الميدانية الموصوفة هنا هو نظام السلوكي تنوعا لدراسة ردود حاسة الشم لوجود أعداد كبيرة من النوع البري ومتحولة ذبابة الفاكهة الذباب. يأخذ كل تجربة ~ 1 ساعة (بما في ذلك الإعداد، التشغيل التجريبي، والتنظيف)، و4-6 التجارب لا يمكن أن يؤديها بشكل روتيني كل ي?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Terry Shelley for manufacturing the fly arena and the light-tight enclosure, Liz Marr for help with fly stock maintenance, and Xiaojing Gao and Junjie Luo for help with the Matlab code used for data analysis. We thank Johan Lundström at the Monell Chemical Senses Center for demonstrating his odor delivery setup. This work was supported by grants from the Whitehall Foundation (CJP) and NIH NIDCD (R01DC013070, CJP).
Materials
| Air delivery system | (Quantity needed) | ||
| Tubing and connectors | |||
| Thermoplastic NPT(F) Manifolds | Cole-Parmer, IL, USA | R-31522-31 | 1 |
| Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT) | McMaster-Carr, IL, USA | 5232T314 | 1 |
| Tubing (ID:1/8) | McMaster-Carr, IL, USA | 5108K43 | 50Ft |
| Tubing (ID:1/16) | McMaster-Carr, IL, USA | 52355K41 | 100Ft |
| Barbed tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5117K71 | 1pack |
| Push-to-connect tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5779K102 | 4 |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K439 | 1 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K438 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K4 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5670K84 | 1 |
| Hex head plug | McMaster-Carr, IL, USA | 48335K152 | 1 |
| Air pressure regulator, air filter and flowmeters | (Quantity needed) | ||
| Labatory gas drying unit | W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA | Model: L68-NP-303; stock #26840 | 1 |
| Multitube frames for 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-30 | 1 |
| Multitube frames for 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-76 | 1 |
| 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R-03217-15 | 9 |
| Valve Cartridge | Cole-Parmer, IL, USA | R-03218-72 | 9 |
| Precision Air regulator | McMaster-Carr, IL, USA | 6162K13 | 1 |
| Soleniod valves | Automate Scientific, Berkeley, CA | 02-10i | 4 |
| Solenoid valve controller | ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA | 01-18 | 1 |
| Electronic flow meter | Honeywell | AWM3100V | 1 |
| DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a | National Instruments | NI USB-6009 | 1 |
| Power supply | Extech Instruments | 382200 | 1 |
| Odor chambers | |||
| Polypropylene Wide Mouth jar 2oz; 60ml | Nalgene | 562118-0002 | At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114) |
| Glass odor chamber, 0.25 oz | Sunburst Bottle | LB4B | At least 5 are required per experiment |
| "In" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 214224PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| "Out" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 224214PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| O ring | RT Dygert International, MN, USA | AS568-029 Buna-N O-R | 1 pack (100) |
| Fly arena, camera and behavior boxes | (Quantity needed) | ||
| Behavior and camera box material | Interstate plastics, CA, USA | ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php) | 1803 sq inch |
| Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12"x12" | McMaster-Carr, IL, USA | 8545K27 | 1 |
| Glass plates, 1/8" Thick, 9"x 9" | McMaster-Carr, IL, USA | 8476K191 | 2 |
| Dual action thermoelectric controller | WAtronix Inc, CA, USA | DA12V-K-0 | 1 |
| IR LED array | Advanced Illumination, Rochester, VT, USA | AL4554-88024, PS24-TL | 2 LED arrays and one power supply |
| Air conditioner Unit | Melcor Store | MAA280T-12 | 1 |
| Imaging system | (Quantity needed) | ||
| Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5mm F/1.4) C-mount Lens | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | PEC21211 KP | 1 |
| CCXC-12P05N Interconnect Cable | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SOCCXC12P05N | 1 |
| DC-700 Camera Adapter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SODC700 | 1 |
| B+W 40,5 093 IR filter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | 65-072442 | 1 |
| TiFFEN 40.5mm Circular polarizer | Amazon | 1 | |
| IR Videocamera | Industrial Vision Source, FL, USA | Sony XC-EI50 (SY-XC-E150) | 1 |
| USB video converter | The Imagingsource, NC, USA | DFG/USB2-It | 1 |
| iFlySpy2 (fly tracking software) | Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com | iFlySpy2 | 1 |
| IC Capture 2.2 software | The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/) | ||
| Miscellaneous | (Quantity needed) | ||
| Dremel rotary tool | Dremel, Racine, WI, USA | Dremel 8000-03 | 1 |
| Diamond-coated drill bits for glass cutting | Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY | 90606328 | 1 |
Referências
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (3), 1112-1119 (1967).
- Thorpe, W. H. Further studies on pre-imaginal olfactory conditioning in insects. Proc R Soc B. 127 (848), 424-433 (1939).
- Tully, T., Quinn, W. G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster. J Comp Physiol A. 157 (2), 263-277 (1985).
- Anholt, R. R., Mackay, T. F. Quantitative genetic analyses of complex behaviours in Drosophila. Nat Rev Genet. 5 (11), 838-849 (2004).
- Vosshall, L. B. Into the mind of a fly. Nature. 450 (7167), 193-197 (2007).
- Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila. Sleep. 31 (4), 465-472 (2008).
- Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nat Methods. 6 (4), 297-303 (2009).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Aso, Y., et al. Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila. Elife. 3, e04580 (2014).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Pfeiffer, B. D., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genética. 186 (2), 735-755 (2010).
- Venken, K. J., et al. Genome engineering: Drosophila melanogaster and beyond. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. , (2015).
- Diao, F., et al. Plug-and-play genetic access to drosophila cell types using exchangeable exon cassettes. Cell Rep. 10 (8), 1410-1421 (2015).
- Lin, C. C., Prokop-Prigge, K. A., Preti, G., Potter, C. J. Food odors trigger Drosophila males to deposit a pheromone that guides aggregation and female oviposition decisions. Elife. 4, (2015).
- Pettersson, J. An aphid sex attractant. Insect Systematics & Evolution. 1 (1), 63-73 (1970).
- Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459 (7244), 218-223 (2009).
- Vet, L. E. M., Lenteren, J. C. V., Heymans, M., Meelis, E. An airflow olfactometer for measuring olfactory responses of hymenopterous parasitoids and other small insects. Physiological Entomology. 8 (1), 97-106 (1983).
- Faucher, C., Forstreuter, M., Hilker, M., de Bruyne, M. Behavioral responses of Drosophila to biogenic levels of carbon dioxide depend on life-stage, sex and olfactory context. J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2739-2748 (2006).
- Katsov, A. Y., Clandinin, T. R. Motion processing streams in Drosophila are behaviorally specialized. Neuron. 59 (2), 322-335 (2008).
- Gao, X. J., et al. Specific kinematics and motor-related neurons for aversive chemotaxis in Drosophila. Curr Biol. 23 (13), 1163-1172 (2013).
- Gao, X. J., Clandinin, T. R., Luo, L. Extremely sparse olfactory inputs are sufficient to mediate innate aversion in Drosophila. PLoS One. 10 (4), e0125986 (2015).
- Ronderos, D. S., Lin, C. C., Potter, C. J., Smith, D. P. Farnesol-detecting olfactory neurons in Drosophila. J Neurosci. 34 (11), 3959-3968 (2014).
- Riabinina, O., et al. Improved and expanded Q-system reagents for genetic manipulations. Nat Methods. 12 (3), 219-222 (2015).
- Lundstrom, J. N., Gordon, A. R., Alden, E. C., Boesveldt, S., Albrecht, J. Methods for building an inexpensive computer-controlled olfactometer for temporally-precise experiments. Int J Psychophysiol. 78 (2), 179-189 (2010).
- Colinet, H., Renault, D. Metabolic effects of CO2 anaesthesia in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 8 (6), 1050-1054 (2012).
- Ramdya, P., et al. Mechanosensory interactions drive collective behaviour in Drosophila. Nature. 519 (7542), 233-236 (2015).
- Ofstad, T. A., Zuker, C. S., Reiser, M. B. Visual place learning in Drosophila melanogaster. Nature. 474 (7350), 204-207 (2011).
- Beshel, J., Zhong, Y. Graded encoding of food odor value in the Drosophila brain. J Neurosci. 33 (40), 15693-15704 (2013).
- Steck, K., et al. A high-throughput behavioral paradigm for Drosophila olfaction – The Flywalk. Sci Rep. 2, 361 (2012).
- Thoma, M., Hansson, B. S., Knaden, M. High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm. J. Vis. Exp. (106), (2015).
- Claridge-Chang, A., et al. Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry. Cell. 139 (2), 405-415 (2009).
- Parnas, M., Lin, A. C., Huetteroth, W., Miesenbock, G. Odor discrimination in Drosophila: from neural population codes to behavior. Neuron. 79 (5), 932-944 (2013).
