Summary

ワンステップの負のクロマトグラフィー精製<em>ヘリコバクター・ピロリ</emで過剰発現>好中球活性化タンパク質<em>エシェリヒア・コリ</em>バッチモードでの

Published: June 18, 2016
doi:

Summary

バッチモードでジエチルアミノ樹脂を使用して、 大腸菌中で過剰発現組換えヘリコバクター・ピロリ好中球活性化タンパク質(HP-NAP)のワンステップ負精製が記載されているため、高い歩留まり方法。この方法によって精製されたHP-NAPはH.のためのワクチン、薬、または診断薬の開発のために有益ですピロリ菌は、病気を-関連しました

Abstract

ヘリコバクター・ピロリ好中球活性化タンパク質(HP-NAP)は、 ヘリコバクター・ピロリピロリ菌 )の主要な病原性因子です。それは、Hで重要な役割を果たしていますピロリ菌は、好中球、単球、およびマスト細胞を含むいくつかの先天性白血球を活性化することによって、胃の炎症を誘発しました。 HP-NAPの免疫原性および免疫調節特性はH.のための潜在的な診断およびワクチン候補となりますピロリ菌および癌治療のための新薬候補。その臨床応用に使用される精製されたHP-NAPの実質的な量を得るために、高い収率及び純度で、このタンパク質を精製する効率的な方法を確立する必要があります。

このプロトコルでは、ジエチルアミノエチル(DEAE)イオン交換樹脂を使用して、 大腸菌 (E. coli)中で過剰発現組換えHP-NAPのワンステップネガティブクロマトグラフィー精製の ​​ための方法を記載している( 例えば 、セファデックス)をiがn個のバッチモード。組換えHP-NAPは、E中の全タンパク質の約70%を構成しています大腸菌とは、ほぼ完全にpHが9.0で、細胞溶解の際に可溶性画分に回収されます。 pH8.0の最適条件の下では、HP-NAPの大部分は、非結合画分に回収される一方、Eからの内因性タンパク質大腸菌を効率的樹脂によって除去されます。

DEAEイオン交換樹脂を用いてネガティブモードバッチクロマトグラフィーを使用して、この精製方法は、Eからの機能HP-NAPを生じます高い収率および純度でその本来の形で大腸菌 。精製されたHP-NAPは、さらに予防、治療、およびHの予後のために利用することができますピロリ菌は、病気だけでなく、癌治療を-関連しました。

Introduction

ヘリコバクター・ピロリピロリ菌)は、胃炎や消化性潰瘍の主な原因です。この細菌はまた、1994年にそれはHの有病率と推定されている、世界保健機関の一部、国際がん研究機関により、ヒトでの発がん性物質として分類されていますpylori感染は発展途上国では70%と先進国1 30〜40%です。たとえH.の感染率ピロリ菌は 、先進国ではH.の感染率を減少しています発展途上国でのピロリ菌は依然として高い2です。 H.を根絶するための標準的な治療法pylori感染は、プロトンポンプ阻害薬、PPI、および2種の抗生物質、クラリスロマイシンプラスアモキシシリンまたはメトロニダゾール3の投与からなります。 H.における抗生物質耐性のが、上昇ピロリ関連の潰瘍の治療は、Oを防止するための新しい戦略の開発を促しますrの感染症を治します。 H.に対する予防および/ ​​または治療的ワクチン接種の開発ピロリ菌は、H 制御するための別のアプローチを提供することができますピロリ感染。

ヘリコバクター・ピロリ好中球活性化タンパク質(HP-NAP)、Hピロリ菌の主要な病原性因子は、最初のH.の水抽出物中で同定されました内皮細胞との反応性酸素種(ROS)4を生成するために付着する好中球を活性化する能力を有するピロリ菌H.で見つかった胃粘膜の好中球の浸潤pylori-アクティブ胃炎に感染した患者は、胃の炎症および組織損傷をもたらす可能性があります。したがって、HP-NAPはさらに潰瘍またはH.を引き起こす胃の炎症を誘発するために、好中球を活性化することによって病理学的役割を果たし得ますピロリ菌は胃の病気を-関連しました。それにもかかわらず、HP-NAPは、臨床応用5,6のための潜在的な候補です。免疫原性および免疫調節プロへHP-NAPのpertiesは、このタンパク質は、ワクチン、治療薬、および診断ツールを開発するために使用することができます。臨床試験は、Hに対するタンパク質ワクチンのコンポーネントの1つとして、組換えHP-NAPを使用するために行われていますピロリ菌 。このワクチンは、水酸化アルミニウムとともに処方組換えHP-NAP、細胞毒素関連遺伝子A(CagAタンパク質)、および空胞化細胞毒A(のVacA)タンパク質で構成され、さらに安全かつ人間7において免疫原性であることが実証されています。また、HP-NAPは、Tヘルパー1型(Th1)をトリガするために、強力な免疫調節剤として作用する癌治療の8のための免疫応答を-polarizedダウンアレルギー反応や寄生虫感染9,10によって誘発されたTh2媒介性免疫応答を調節します。診断に関しては、組換えHP-NAPベースのELISAは、HでHP-NAPに対する血清抗体を検出するために適用されていますピロリ菌は、患者11に感染し。ある研究では、Hからの血清中のHP-NAP特異的抗体のレベルことを示しましたパラグアイロリは胃癌の患者は慢性胃炎12を有する患者からのものよりも有意に高かったに感染し。別の研究では、HP-NAPに対する血清抗体は、非噴門、胃腺癌13の存在と関連していることが示されました。従って、組換えHP-NAPベースのELISAは、Hで胃癌の予後のためのHP-NAPに対する血清抗体を検出するために適用することができますピロリ菌は、患者に感染し。まとめると、精製されたHP-NAPは、さらに予防、治療、およびHの予後のために利用することができますピロリ菌は、病気だけでなく、癌治療を-関連しました。

これまでに報告され、その天然の形態で( 大腸菌大腸菌で発現された組換えHP-NAPの精製に使用されるいくつかの方法の中でも、ゲル濾過クロマトグラフィーを含む第二の精製工程は、高純度のHP-NAP 14-16を得るために必要とされます。ここでは、負モードバッチクロマトグラフィーを用いた方法ジエチルアミノエチル(DEAE)イオン交換樹脂は、Eで過剰発現HP-NAPの精製の ​​ために記載されています高収率、高純度で大腸菌 。この精製技術は、宿主細胞のタンパク質および/または樹脂HP-NAP以外の不純物の結合に基づいていました。 pH8.0で、HP-NAPを除いてほとんどなく、他のタンパク質は、非結合画分から回収されます。ネガティブモードでDEAEイオン交換クロマトグラフィーを使用して、この精製アプローチは、非結合画分のコレクションを1段階クロマトグラフィーにより組換えHP-NAPの精製を可能にすることにより、簡単かつ時間の節約です。 図17に示すように 、免疫グロブリンG(IgG)18、ヘモグロビン19、タンパク質ホスファターゼ20、および毒性因子フラジェリン21ウイルスなどの、負にイオン交換クロマトグラフィーによって精製することが報告されているようなHP-NAP、いくつかの他の生体分子に加えてモード。不純物が軽微である場合、ネガティブモードでは、イオン交換クロマトグラフィーが好ましいです22を精製するために供される試料中に存在する成分。天然または組換え生体分子の精製における負のクロマトグラフィーの適用は、最近23を検討されています。

本レポートでは、 大腸菌における組換えHP-NAPの発現のためのステッププロトコルでステップを提供しますDEAEイオン交換樹脂とネガティブモードバッチクロマトグラフィーを用いて大腸菌細胞の溶解、およびHP-NAPの精製。精製のために、所望のタンパク質は、ネガティブモードでのイオン交換クロマトグラフィーに適している場合、記載されたプロトコルはまた、精製プロセスの開発のための出発点として適合させることができます。

Protocol

ヒトの血液は、国立清華大学の治験審査委員会、新竹、台湾からの事前の書面によるインフォームドコンセント及び承認を得て、健康なボランティアから採取しました。 大腸菌における組換えHP-NAPの1式大腸菌 H.からHP-NAPのDNA配列を含むプラスミドpET42a-NAPを準備ピロリ菌 26695株は、以前に16を説明しました。説明したように所望の点変異を有?…

Representative Results

組換えHP-NAPの負の浄化の実験手順の概略図は、Eで表現しましたバッチモードでDEAEイオン交換樹脂を用いて、 大腸菌は 、図1に示されている。この精製技術は、宿主細胞タンパク質および/ ​​または樹脂HP-NAP以外の不純物の結合に基づいています。 pH8.0で、その本来の形でのHP-NAPを除いてほとんどない他のタンパク質は、非結合画分( <stron…

Discussion

ここで提示DEAE陰イオン交換樹脂とネガティブモードバッチクロマトグラフィーは、 大腸菌で過剰発現する組換えHP-NAPの精製に適しています。細胞溶解および精製の ​​工程において使用される緩衝液のpH値は、EでHP-NAPの溶解性を確保するために非常に重要です大腸菌溶解物およびそれぞれの宿主細胞不純物から組換えHP-NAPの効率的な分離。細菌細胞は、pH 9.0に溶解され?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Dr. Chao-Sheng Cheng at National Tsing Hua University, Taiwan, for performing the circular dichroism measurement. We also thank Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA, for providing the anti-HP-NAP monoclonal antibody. We appreciate Drs. Han-Wen Chang and Chung-Chu Chen at Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for providing advice for IRB application, Mr. Te-Lung Tsai at the Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for supervising the analysis of isolated neutrophils, and Ms. Ju-Chen Weng at National Tsing Hua University, Taiwan, for her technical assistance. This work was supported by grants from the Ministry of Science and Technology of Taiwan (MOST 104-2311-B-007-003, NSC101-2311-B-007-007 and NSC98-2311-B-007-006-MY3), the Joint Research Program of National Tsing Hua University and Mackay Memorial Hospital (100N7727E1, 101N2727E1, 103N2773E1), and the research program of National Tsing Hua University (104N2052E1).

Materials

Material
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Spectrum/Por dialysis tubing Spectrum Laboratories 132720 with molecular weight cutoff of 14 kDa
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Acrodisc® units with Mustang® E membrane Pall MSTG25E3 for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min
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PlusOne silver staining kit, protein GE Healthcare Life Sciences 17-1150-01 http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001
Ficoll-Paque PLUS GE Healthcare Life Sciences 17-1440-02 for density gradient centrifugation to purify human neutrophils
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure
_16963/17144002
Flat bottom 96-well white plate Thermo Fisher Scientific Inc 236108 http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html
Luminol Sigma-Aldrich A8511 protected from light
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en&region=TW
Expand  long template PCR system Sigma-Aldrich 11681834001 source of High Fidelity PCR enzyme mix
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en&region=TW
Dpn I New England Biolabs R0176S https://www.neb.com/products/r0176-dpni
Xho I New England Biolabs R0146S https://www.neb.com/products/r0146-xhoi
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Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge Hitachi Koki Co 90106401 for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates
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ÄKTA FPLC GE Healthcare Life Sciences 18-1900-26 for gel filtration chromatography
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LAS-3000 imaging system Fujifilm N/A discontinued and replaced
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Citar este artigo
Kuo, T., Hong, Z., Tsai, C., Yang, Y., Fu, H. One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode. J. Vis. Exp. (112), e54043, doi:10.3791/54043 (2016).

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