Summary

طريقة لاستهداف وعزل مجرى الهواء-التعصيب الخلايا العصبية الحسية في الفئران

Published: April 19, 2016
doi:

Summary

Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.

Abstract

الأعصاب الحسية الجسدية تنبيغ الحرارية والميكانيكية والكيميائية، والمحفزات الضارة الناجمة عن كل من وكلاء الذاتية والبيئية. توجد أجسام الخلايا من هذه الخلايا العصبية وارد في العقد الحسية. العقد الحسية يعصب جهاز معين أو جزء من الجسم. على سبيل المثال، توجد العقد الجذرية الظهرية (DRG) في العمود الفقري وتوسيع العمليات في جميع أنحاء الجسم والأطراف. وتقع العقد مثلث التوائم في الجمجمة وعصب الوجه والمجاري التنفسية العليا. afferents العصب الحائر من العقد العقداء تمتد في جميع أنحاء الأمعاء والقلب والرئتين. الخلايا العصبية العقداء تسيطر مجموعة متنوعة من الوظائف مثل: معدل التنفس، وتهيج الشعب الهوائية، وردود الفعل السعال. وهكذا، لفهم والتعامل مع وظيفتها، فمن الأهمية بمكان لتحديد وعزل مجرى الهواء محددة العصبية الفرعية من السكان. في الماوس، ويتعرض الشعب الهوائية إلى الصبغة الكاشفة الفلورسنت، الوجبات الأزرق، للبحث عن المفقودين إلى الوراء ل-مجرى الهواء محددة كثير العقد العصبيةالصورة. ونأت العقدة العقداء ويستخدم مضان خلية المنشط (FAC) الفرز لجمع الخلايا إيجابية الصبغة. بعد ذلك، يتم استخراج الحمض النووي الريبي جودة عالية (RNA) من صبغ خلايا إيجابية لتسلسل الجيل القادم. باستخدام هذا الأسلوب الهوائية يتحدد التعبير الجيني العصبية محددة.

Introduction

الأعصاب الحسية الجسدية تنبيغ الحرارية والميكانيكية والكيميائية، والمحفزات الضارة الناجمة عن كل من وكلاء الذاتية والبيئية. وتقع الهيئات خلية من هذه الأعصاب وارد في العقد الحسية، مثل الجذر الظهري، مثلث التوائم، أو العقد عقدي. كل العقدة الحسية يعصب مناطق محددة من الجسم، وتحتوي الخلايا التي يعصب أعضاء وأنسجة منفصلة داخل تلك المنطقة. على سبيل المثال، توجد العقد الجذرية الظهرية (DRG) في العمود الفقري وتوسيع العمليات في جميع أنحاء الجسم والأطراف، بينما تقع العقد مثلث التوائم في الجمجمة، والتي تحتوي على الخلايا العصبية التي يعصب الوجه والعينين، السحايا أو العليا الهوائية 1، 2. يقع العقد العقيدي من العصب المبهم في الرقبة تحت الجمجمة ويحتوي على أجسام الخلايا التي تمتد الألياف العصبية في جميع أنحاء الجهاز الهضمي والقلب، وانخفاض الهوائية والرئتين 3. في البشر العقدة العقداء تقف وحدها، ولكن في الماوس وتنصهر ذلكمع العقدة الوريد، والتي يعصب أيضا الرئتين 4. وغالبا ما تسمى هذه العقدة تنصهر الوداجي / معقدة كثير العقد، العقدة العصب الحائر، أو ببساطة العقدة العقداء 5. هنا، ويشار إليها باسم العقدة العقداء.

الألياف وارد في كثير العقد تمرير المعلومات من الأحشاء لنواة السبيل المفرد (NTS) في الدماغ. المدخلات الحسية لهذه العقدة فريدة يسيطر على مجموعة متنوعة من الوظائف، مثل الأمعاء على الحركة 7 معدل ضربات القلب والتنفس 8،9، واستجابات الجهاز التنفسي تنشيط إزعاج 10،11. مع هذا التنوع في الوظائف وأجهزة معصب، فمن الأهمية بمكان لاستهداف وعزل القطعان-جهاز معين من العقدة العقداء من أجل دراسة مسارات العصبية الفردية. ومع ذلك، ونظرا لصغر حجم كثير العقد وعدد محدود من الخلايا العصبية التي يتضمنها هذا ليس بالأمر الهين. كل فأر كثير العقد العقدة يحتوي على ما يقرب من 5000 الخلايا العصبية 12بالإضافة إلى السكان واسعة من دعم الخلايا الأقمار الصناعية. من 5000 الخلايا العصبية العقداء، فقط 3-5٪ يعصب الشعب الهوائية. ولذلك، فإن أي تغييرات وظيفية، المورفولوجية أو الجزيئية في الخلايا العصبية الهوائية-التعصيب، بسبب تحفيز الجهاز التنفسي أو أمراض، سوف تضيع في العقدة العقداء المزدحمة بالسكان.

لحل هذه المشكلة، تم تطوير طريقة لتحديد وعزل الخلايا العصبية التي يعصب الشعب الهوائية. تعرضت الشعب الهوائية إلى الصبغة الكاشفة الفلورسنت لتحديد اللاحقة الخلايا العصبية التعصيب كثير العقد. اختير سريع الأزرق من قبل الخلايا العصبية، ويسافر بسرعة إلى الهيئات المحمولة الخاصة بهم حيث يتم الاحتفاظ بها لمدة تصل إلى ثمانية أسابيع 13-15. وبمجرد تحديدها، وكان يستخدم لطيف، وكفؤ، بروتوكول التفكك للحفاظ على وضع العلامات صبغ وبقاء الخلية لفلوري خلية المنشط (FAC) وحدة الفرز. تستخدم الخلايا الترتيب لاستخراج الحمض النووي الريبي جودة عالية (RNA) لتحديد التعبير الجيني أو وأو غيرها من التحليل الجزيئي المصب. يوفر هذا البروتوكول تقنية مفيدة وقوية لعزل الخلايا العصبية الحسية التي يعصب على الأنسجة من الاهتمام.

Protocol

وقد تمت الموافقة على الإجراءات التي تجرى على الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من جامعة ديوك. 1. إدارة الطريق الأنفي من الأزرق سريع للأزرق سريع، إدارة الصبغة لا يقل عن 2 أيام قبل القتل الرحي…

Representative Results

باستخدام هذه الطريقة، وصفت الخلايا العصبية الهوائية-التعصيب خلال غرس الأنف سريع الأزرق (الشكل 1A). بعد يومين، تظهر سريعة خلايا الأزرق المسمى في العقد العقيدي (الشكل 1C). هذه الخلايا تشكل 3-5٪ من مجموع السكان الخلايا العصبية من العقد ع?…

Discussion

يصف هذا البروتوكول وسيلة لاستهداف الخلايا العصبية الهوائية-التعصيب في العقد العقيدي من العصب المبهم. مرة واحدة وصفت، وفصل في العقد بلطف للحفاظ على النحو الأمثل أعداد الخلايا وقدرتها على البقاء. هذه الخلايا العصبية هي ثم فرزها القوات المسلحة الكونغولية مباشرة إلى ت?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

بدعم من المعاهد الوطنية للصحة منح R01HL105635 إلى SEJ. فإن الكتاب أود أن أشكر دييغو خامسا Bohórquez للحصول على المشورة الفنية. كما نشكر ر إيان كومينغ للحصول على المساعدة الفنية وأداء التدفق الخلوي في مرفق دوق لقاح الإنسان معهد بحوث التدفق الخلوي الموارد المشتركة (دورهام بولاية نورث كارولاينا). التدفق الخلوي أجريت في مختبر الاحتواء البيولوجي الإقليمي في جامعة ديوك الذي حصل على دعم جزئي للبناء من المعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (UC6-AI058607).

Materials

Fast Blue Polysciences, Inc. 17740-2 stock 2 mg/ml in water
NeuroTrace 530/615 red Nissle stain Life Technologies N21482
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D128-500
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free Gibco 14190-144
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634-010
glutamine (Glutamax) Gibco 35050-061
HEPES Gibco 15630-080
N2 Gibco 17502-048
B27 (no vitamin A) Gibco 12587-010
Nerve Growth Factor (NGF) Sigma N6009 stock 50 µg/ml in PBS/10% FBS
digestion enzyme, Liberase DH Research Grade Roche 5401054001 stock 2.5 mg/ml in water
particle solution (Percoll) Sigma P1644-25ML
Heating block LabNet
70 um cell strainer Falcon 352350
Absolute Ethanol (200 proof) Fisher Scientific BP2818-500
RNase free water Fisher Scientific BP2484-100
RNase decontamination reagent, RNase AWAY invitrogen 10328-011
2-mercaptoethanol VWR EM-6010
RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit Qiagen 74034
DNase kit, RNase-Free DNase Set Qiagen 79254
DNase Sigma D5025-15KU stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl
Propidium Iodide Sigma P4170-10MG stock 10 µg/ml in PBS
Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200) Agilent

Referências

  1. Manteniotis, S., et al. Comprehensive RNA-Seq Expression Analysis of Sensory Ganglia with a Focus on Ion Channels and GPCRs in Trigeminal Ganglia. PLoS One. 8 (11), 1-30 (2013).
  2. Vandewauw, I., Owsianik, G., Voets, T. Systematic and quantitative mRNA expression analysis of TRP channel genes at the single trigeminal and dorsal root ganglion level in mouse. BMC Neurosci. 14 (1), 21 (2013).
  3. Paintal, A. S. Vagal sensory receptors and their reflex effects. Physiol Rev. 53 (1), 159-227 (1973).
  4. Springall, D. R., Cadieux, A., Oliveira, H., Su, H., Royston, D., Polak, J. M. Retrograde tracing shows that CGRP-immunoreactive nerves of rat trachea and lung originate from vagal and dorsal root ganglia. J Auton Nerv Syst. 20 (2), 155-166 (1987).
  5. Ricco, M. M., Kummer, W., Biglari, B., Myers, A. C., Undem, B. J. Interganglionic segregation of distinct vagal afferent fibre phenotypes in guinea-pig airways. J Physiol. 496 (Pt 2), 521-530 (1996).
  6. Zhao, H., Sprunger, L. K., Simasko, S. M. Expression of transient receptor potential channels and two-pore potassium channels in subtypes of vagal afferent neurons in rat. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298 (2), 212-221 (2010).
  7. Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J. Neurochemistry of the nodose ganglion. Prog Neurobiol. 52 (2), 79-107 (1997).
  8. Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal Sensory Neuron Subtypes that Differentially Control Breathing. Cell. 161, 1-12 (2015).
  9. Kaczyńska, K., Szereda-Przestaszewska, M. Nodose ganglia-modulatory effects on respiration. Physiol Res. 62, 227-235 (2013).
  10. Taylor-Clark, T. E., Undem, B. J. Sensing pulmonary oxidative stress by lung vagal afferents. Respir Physiol Neurobiol. 178 (3), 406-413 (2011).
  11. Bautista, D. M., et al. TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents. Cell. 124 (6), 1269-1282 (2006).
  12. Ichikawa, H., De Repentigny, Y., Kothary, R., Sugimoto, T. The survival of vagal and glossopharyngeal sensory neurons is dependent upon dystonin. Neurociência. 137 (2), 531-536 (2006).
  13. Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Res. 1319, 60-69 (2010).
  14. Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. Neurociência. 49 (3), 715-737 (1992).
  15. Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: A comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117 (2), 167-172 (2002).
  16. Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat. J Vis Exp. (93), e1-e5 (2014).
  17. Ramachandra, R., McGrew, S., Elmslie, K. Identification of specific sensory neuron populations for study of expressed ion channels. J Vis Exp. (82), e50782 (2013).
  18. Yu, X., Hu, Y., Ru, F., Kollarik, M., Undem, B. J., Yu, S. TRPM8 function and expression in vagal sensory neurons and afferent nerves innervating guinea pig esophagus. Am J Physiol – Gastrointest Liver Physiol. 308 (6), 489-496 (2015).
  19. Kwong, K., Lee, L. -. Y. PGE(2) sensitizes cultured pulmonary vagal sensory neurons to chemical and electrical stimuli. J Appl Physiol. 93 (4), 1419-1428 (2002).
  20. Joachim, R. A., et al. Stress induces substance P in vagal sensory neurons innervating the mouse airways. Clin Exp Allergy. 36 (8), 1001-1010 (2006).
  21. Kaan, T. K. Y., et al. Systemic blockade of P2X3 and P2X2/3 receptors attenuates bone cancer pain behaviour in rats. Brain. 133 (9), 2549-2564 (2010).
  22. Nakatani, T., Minaki, Y., Kumai, M., Ono, Y. Helt determines GABAergic over glutamatergic neuronal fate by repressing Ngn genes in the developing mesencephalon. Development. 134 (15), 2783-2793 (2007).
  23. Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9 (3), 443-452 (2006).
  24. Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nat Neurosci. 18, 145-153 (2015).

Play Video

Citar este artigo
Kaelberer, M. M., Jordt, S. A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice. J. Vis. Exp. (110), e53917, doi:10.3791/53917 (2016).

View Video