Establecimiento de Cultivos Celulares del Cáncer Humano de osteosarcoma convencional Tallo

Toda la experimentación utilizando tejidos humanos descritos en este documento fue aprobado por el comité de ética local (Rif. N. 141/12). El consentimiento informado para la recogida de muestras de tejidos y para el uso y almacenamiento de las muestras se obtuvo de los donantes en AOUC. 1. Preparación para la Cultura Preparar medio de cultivo de crecimiento (GM) mediante la adición de 10% suero bovino fetal (FBS), 100 UI / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina y medio F12 de Ham modificado de Coon. Filtrar y esterilizar GM usando un filtro de 0,22 micras. Tienda de GM hasta 1 mes a 4 ° C. Preparar medio colagenasa (CM) mediante la adición de 20% de SFB, 100 UI / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 3 mg / ml de colagenasa tipo II a medio F12 de Ham modificado de Coon. Filtrar y esterilizar CM usando un filtro de 0,22 micras. Tienda CM hasta 1 mes a -20 ° C. Preparar medio de congelación celular (FM) mediante la adición de 40% de SFB, 100 UI / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 60,5% de dimetilsulfóxido (DMSO) a medio F12 de Ham modificado de Coon. Filtrar y esterilizar FM utilizando un filtro de 0,22 micras. Tienda de FM hasta 1 mes a 4 ° C. Preparar medio para el ensayo de CFU (CFUM) mediante la adición de 20% de SFB, 100 UI / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina y medio F12 de Ham modificado de Coon. Filtrar y esterilizar CFUM utilizando un filtro de 0,22 micras. Tienda CFUM hasta 1 mes a 4 ° C. Preparar la tripsina mediante la disolución de 400 mg de tripsina, 200 mg de EDTA y 1,000 mg D (+) – glucosa anhidra en 1000 ml de Dulbecco tamponada con fosfato salino (DPBS) sin Ca2 + y Mg2 +. NOTA: Se divide fresca tripsina-EDTA en 50 ml alícuotas en frascos de 25 cm2 utilizando un filtro de 0,22 micras y congelar a -20 ° C durante un máximo de 3 meses. Tienda descongeló alícuotas de filtro-esterilizado a 4 ° C sin pérdida de actividad. Preparar medio de crecimiento de células madre (SCGM) mediante la adición de 10% de SFB, 100 UI / ml de penicilina, 100 mg / ml streptomycin, y 10 ng / ml de bFGF (25 mg / ml de stock) a medio F12 de Ham modificado de Coon. Filtro SCGM usando un filtro y almacenar SCGM 0,22 micras hasta 2 semanas a 4 ° C. Preparar% metilcelulosa 2 (MC) por disolución de MC en H2O ultrapura a 4 ° C durante 3 días. Cuando MC se disuelva por completo, autoclave y almacenar a 4 ° C. NOTA: Después se esteriliza MC, se convierte en sólido. MC para llevar a un estado líquido, se almacena a 4 ° C. Preparar medio de crecimiento sarcosphere (SGM). Preparar este medio fresco (no más de 2 semanas antes de usar) mediante la adición de 100 IU de penicilina / ml, 100 mg / ml de bFGF (25 g / Stock ml) humana, 20 nM de progesterona (10 mM de stock), 100 mM de putrescina, 30 nM selenita de sodio (30 mM de valores), 25 mg / ml de transferrina (25 mg / Stock ml), 20 mg / ml de insulina (20 mg / ml de solución madre), y 10 ng / EGF humano ml (10 mg / ml de solución madre) a 2X Coon de medio modificado F12 de Ham. Filtrar y esterilizar SGM usando un fil 0,22 micraster. Almacenar hasta por 2 semanas a 4 ° C. Preparar medio osteogénico (OM) mediante la adición de 10% de FBS (origen sudamericano), 100 UI / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 10 nM de dexametasona (100 mM de stock), 0,2 mM de sodio L-ascorbil-2-fosfato (1 m stock), 10 mM de β-glicerofosfato (5 mg / ml de solución madre) y 1 mg / ml de calceína (200 mg / ml de stock) a medio F12 de Ham modificado de Coon. Filtrar y esterilizar OM utilizando un filtro de 0,22 micras. Almacenar a 4 ° C. NOTA: Store Solutions dexametasona sobre acciones en virtud de nitrógeno líquido para mantener su actividad. Preparar OM fresco cada 2 semanas para mantener la actividad de la dexametasona con el fin de mantener el potencial de diferenciación del medio. Preparar tampón de lisis de eritrocitos (ELB) disolviendo 1,66 mg de NH4Cl, 0,2 mg de K 2 HPO 4 y 0,007 mg de EDTA en 200 ml de agua destilada (dH2O). Filtrar y esterilizar ELB utilizando un filtro de 0,22 micras. Almacenar a 4 °DO. Preparar medio adipogénico (AM) mediante la adición de 10% de FBS (origen Sur América), 100 UI / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 1 mM de dexametasona (mM stock 1), 1 mM de insulina bovina (mM Stock 10), 0,5 mM isobutilmetilxantina (IBMX) (mM Stock 500), y 100 indometacina mu M (200 mM) a medio F12 de Ham modificado de Coon. Filtrar y esterilizar AM utilizando un filtro de 0,22 micras. Almacenar a 4 ° C. NOTA: Store Solutions dexametasona sobre acciones en virtud de nitrógeno líquido para mantener su actividad. Preparar AM fresco cada 2 semanas para mantener la actividad de la dexametasona con el fin de mantener el potencial de diferenciación del medio. Preparar 2% albúmina de suero bovino (BSA) en DPBS (BSA / DPBS). Disolver 10 g de BSA en 500 ml de DPBS y preparar la solución stock de alícuotas de 50 ml de solución madre en 50 ml tubos cónicos. Almacenar a -20 ° C. Preparar una solución de 4% de paraformaldehído (PFA) en DPBS (PFA / DPBS). En un chcampana emical, diluido en DPBS paraformaldehído y preparar la solución stock de alícuotas de 50 ml de solución madre en 50 ml tubos cónicos. Almacenar a 4 ° C. 2. El establecimiento de cultivos celulares primarios OS y OS líneas celulares finitas (OSA) NOTA: los cultivos de células del sistema operativo primario se prepararon a partir de muestras de biopsias frescas OS convencionales recogidos en la "Unità Ortopedia Oncológica e Ricostruttiva", AOUC Careggi, Florencia. Todas las biopsias, que se obtuvieron por aspiración con aguja o la resección quirúrgica de una pequeña porción del tumor (Figura 1A, B), se colocaron inmediatamente en un medio de cultivo suplementado con 100 UI / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina (pH 7,4) y transportados al laboratorio en el que se procesaron. Todas las manipulaciones descritas se realizaron en condiciones asépticas utilizando una campana de flujo laminar. Aislamiento de células del sistema operativo Colocar la biopsia en una100 mm placa de Petri con un pequeño volumen de GM. Con una lanceta estéril y pinzas Perry, pelos en las muestras de tejido OS cortándolos en piezas tan pequeñas como sea posible (0,5 – 1 mm) (Figura 2A, B). Cubrir los fragmentos de tejido con CM 10 ml para la digestión enzimática (Figura 2B) y se incuba durante 3 h en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. eliminar suavemente la suspensión de fragmentos usando una pipeta y transferirlo a un tubo cónico de 15 ml para la centrifugación inmediata (400 xg durante 5 min) para sedimentar los fragmentos. NOTA: Después de la centrifugación, si las biopsias son ricos en los eritrocitos, un depósito de color rojo compuesto de eritrocitos puede ser visto a través de los fragmentos. Por lo tanto, antes de proceder a la dispersión mecánica, el tratamiento de la muestra con tampón de lisis de eritrocitos. Eliminar el sobrenadante por aspiración y se añaden 5 ml ELB. Suspender fragmentos de pellets de 1 min y se centrifuga la suspensión a 400 xg durante 2min. Eliminar el sobrenadante por aspiración. Añadir 5 ml de GM y mecánicamente dispersar los fragmentos usando una pipeta serológica de 10 ml (tamaño de la abertura, de 1,5 mm de diámetro interno) 10 – 20 veces. Centrifugar la suspensión a 400 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante por aspiración, suspender el sedimento celular con 10 ml de GM, y luego transferir la suspensión celular resultante en una placa de Petri de 100 mm. Incubar la placa de Petri en un 37 ° C, 5% de CO2 y reemplazar el GM con total GM fresco cada 3 d. NOTA: Muy a menudo, las muestras de tejido OS obtenidas por aspiración con aguja son muy pequeñas y contiene fragmentos de hueso, que no son digeridos por digestión enzimática con colagenasa. Por lo tanto, después de que el sobrenadante se ha eliminado, el intento de separar las células de tejido óseo por maceración fragmentos de pellets con una pipeta. Subcultura NOTA: Para establecer un OSA, cuando las células alcanzan la confluencia aproximada, sacarlos de their recipiente de cultivo, diluir, y colocar en un plato fresco para permitir un mayor crecimiento. Este procedimiento de subcultivo se logra mediante el procedimiento enzimático denominado tripsinización. Se elimina el medio por aspiración. Disociar la monocapa de células, añadir 2 – 3 ml de tripsina a TA (max 18 – 20 ° C), agitar suavemente una vez, y retire la tripsina inmediatamente por aspiración. Repetir dos veces. Se incuban las células a 37 ° C durante 3 – 4 minutos hasta que empiecen a separar. NOTA: Bueno tripsinización puede ser visto por el usuario experimentado como pequeños agujeros que se forman en la monocapa ligeramente opaca cuando el plato se lleva a cabo a la luz. Esta disociación también se puede monitorizar usando un microscopio invertido; Se recomienda este enfoque para los principiantes. Detener la reacción tripsina mediante la adición de 10 ml de GM y lavar el plato bien mediante una pipeta para separar todas las células. Se transfiere 1 ml de la suspensión a una nueva placa de Petri de 100 mm y añadir 9 ml de GM (1/10 de división de las células). NOTA: </strong> La suspensión celular restante puede ser utilizado para la expansión de células (transferencia a otro plato de Petri de 100 mm), se pueden criopreservar (ver sección 2.3), o puede ser contado y se sembró en placas experimentales o pozos para ensayos de proliferación u otros fines (véase abajo). Criopreservación de utilizar cultivos primarios y OSA NOTA: Congelar una confluencia de 100 mm placa de Petri en crioviales 4-5. El proceso de criopreservación debe realizarse rápidamente porque DMSO, que protege las membranas celulares durante la congelación, es tóxico para las células a temperaturas de congelación no. Disociar cultivos de células de la monocapa mediante tripsinización (véase la Sección 2.2), las células de pellets por centrifugación a 400 xg durante 5 min, eliminar el sobrenadante por aspiración, y luego suspender rápidamente el sedimento celular en FM. Alícuota de 1 ml de esta suspensión por vial criogénico. Inmediatamente colocar los viales llenos en una caja de congelador con una chaqueta de 2-propanol y almacenar immediatamente a -80 ° CO / N. Transferencia crioviales en nitrógeno líquido al día siguiente para el almacenamiento a largo plazo. Líneas celulares de descongelamiento del sistema operativo y cultivos primarios líneas celulares de descongelamiento del sistema operativo de almacenamiento de nitrógeno líquido, crioviales descongelar rápidamente colocándolos en un baño de agua de laboratorio a 37 ° C. Transferir el contenido de los crioviales en un tubo cónico de 15 ml y añadir aproximadamente 10 ml de GM (Ver Sección 2.3 para eliminar el DMSO). Eliminar el sobrenadante por aspiración y suspender el sedimento celular en 10 ml de GM. Placa de la suspensión de células en una placa de 100 mm Petri y se incuba en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. 3. Ensayo Sarcosphere para aislar células madre cancerosas-OS NOTA: Este experimento se realiza en la AOS. La duración de este experimento se relaciona con la capacidad de las células para formar estas colonias esfera (sarcospheres), y el rango de tiempo es 7, 14, 21, y 28 d. Estabesta- de ensayo sarcosphere Preparar la cámara de hemocitómetro y todos los reactivos de antelación. Se elimina el medio por aspiración y disociar las células de la monocapa por tripsinización (ver sección 2.2). Mezclar la suspensión celular a fondo, pipeteado para dispersar los grumos, y recoger 10 l usando una punta de pipeta de 20 mL. Transferir la suspensión celular 10 l de inmediato al borde cámara de hemocitómetro, expulsar a la suspensión, y permitir que se dibuja bajo el cubreobjetos por acción capilar. Observar la cámara de hemocitómetro bajo contraste de fase. Seleccionar un objetivo de 10X y se centran en las líneas de la cuadrícula en la cámara. Contar las células que se encuentran en esta área de 1 mm 2 usando las subdivisiones (también vinculado por tres líneas paralelas) y líneas de malla individuales como una ayuda para el recuento. Medir la concentración y aplicar la siguiente ecuación: 1 ml = n * 10 4 / z (n: número total de células en todo el contadocuadrados de 1 mm 2; z: el número de cuadrados contados a 1 mm 2). Calcular el volumen de la suspensión de células necesaria a la placa una cantidad total de 240.000 células dividido en 40.000 células por cada pocillo de la placa de fijación de 6 pocillos ultra-bajo. NOTA: Asegúrese de placa el número correcto de células en placas de células en un pocillo adicional. Por lo tanto, la cantidad total de células para ser plateado es 280.000 células. Preparar 35 ml SGM mediante la adición de 50% de 2% MC (SGM-MC) en un matraz de 25 cm2. Preparar el volumen total de 5 ml SGM considerando adicional con el fin de placa de un pozo adicional. Añadir el volumen calculado de la suspensión celular a la SGM-MC preparado en el matraz y mezclar suavemente con una pipeta para dispersar los grumos. Placa de las células en una placa de fijación 6 pocillos ultra-bajo y el uso de un microscopio invertido para observar cómo aparecen las células después de haber sido chapado. Se incuban las células en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. Cada 3 d, añadir fralícuotas de ESH de bFGF y EGF a cada pocillo para refrescar la concentración de los factores de crecimiento. Añadir 2 l bFGF y EGF 5 l para mantener tanto a la concentración final de 10 ng / ml en cada pocillo. Aislamiento de sarcospheres NOTA: Monitor de la buena marcha del ensayo sarcosphere a los 7, 14, 21 y 28 d para decidir cuando es necesario aislar los sarcospheres que se formaron. Preparar todos los reactivos y el equipo en la campana de flujo laminar (Figura 3A, B). Montar la unidad de filtración mediante la colocación de un filtro de red de diámetro 25 mm y una malla de 40 micras en un soporte de filtro de membrana; esterilizar en autoclave (Figura 4A-E). Para cada pocillo, transferir el medio que contiene los sarcospheres a una jeringuilla con un soporte de filtro de membrana estéril usando una pipeta estéril con una punta de 1,000 l. Después de eliminar completamente el medio que contiene los sarcospheres, lavar el bien por añadiring 5 ml de GM para estar seguro de transferir todas las esferas a una jeringa. Utilizar el microscopio para confirmar si todos los sarcospheres han sido recuperados. Si no es así, continúe repitiendo este paso. Filtrar la suspensión con un soporte de filtro de membrana sólo por la gravedad sin presión con el fin de evitar daños en las esferas y para evitar que tienen sarcospheres que cruzan a través del filtro, evitando así la pérdida de esferas. Eliminar las burbujas de aire mediante el uso suavemente una pipeta Pasteur de vidrio estéril. NOTA: A veces la filtración es bloqueado por la presencia de una burbuja de aire en el soporte de filtro de membrana. Lavar la unidad de filtración mediante la adición de 10 ml de GM a la jeringa y dejar que se filtre y sin presión para asegurarse de eliminar las células individuales. Desmontar la unidad de filtro de la jeringa y ponerlo en una placa de Petri. Retire el filtro de red desde el soporte del filtro de membrana con unas pinzas Perry y lavarlo sacudiéndolo suavemente con las pinzas en un 60 mmplaca de Petri para liberar los sarcospheres de la maraña de la membrana. A continuación, colocar la membrana en un pozo y confirmar mediante observación microscópica que no hay más esferas enredados en la membrana. Si esferas todavía están enredados en la membrana, proceder con otro lavado como se describe en el paso 3.2.4. Tenga en cuenta las sarcospheres liberados utilizando un microscopio. Se incuban las sarcospheres liberados en un 37 ° C, 5% de CO2. Repita todos los pasos para cada pocillo de una placa de fijación de 6 pocillos ultra-bajo. 4. OS-CSC Líneas NOTA: OS-CSC se obtienen de la sarcospheres que exhiben expansión adherente mediante la reintroducción y recultivo estas células en una monocapa después de que se colocaron en placas en pequeñas 60 mm placas de Petri ya no está bajo condiciones de ultra-bajas de fijación. Culturas OS-CSC Para habilitar un mayor crecimiento, las células de subcultivo cuando alcanzan aproximadamente el 90% de confluencia en un 60plato Petri mm. Repita el paso 2.2.1 para establecer cultivos OS-CSC. Deja de tripsina mediante la adición de 4 ml SCGM y lavar bien el plato, utilizando una pipeta para separar todas las células. Transferir la suspensión celular a una nueva placa de Petri de 100 mm y añadir 6 ml SCGM. Cuando llegan a las CSC-OS 90% de confluencia, subcultivo por la sección 2.2 de repetición. NOTA: Para el análisis in vitro para caracterizar el fenotipo de células madre-como de aislados OS-células madre cancerosas, las células se pueden sembrar en diferentes tipos de placas. Preservar las líneas OS-CSC establecidos por la crioconservación (repetir todos los pasos de la sección 2.3). Descongelar el criopreservados OS-células madre cancerosas mediante la repetición de todos los pasos de la sección 2.4. 5. In vitro Un nálisis para caracterizar las CSC-OS: Preparación de células para inmunofluorescencia NOTA: Las células se fijaron en paraformaldehído cuando alcanzan el grado correcto de confluencia en cada pocillo de una pla 24 pocilloste. El grado de confluencia está relacionado con el tipo de experimentos. Placa OS-células madre cancerosas en una placa de 24 pocillos para estudiar los marcadores mesenquimales superficie de las células madre (MSC) por inmunofluorescencia. Fijar las células en cada pocillo cuando alcanzan 50-60% de confluencia. Retire el SCGM por aspiración y se lava dos veces en una placa de 24 pocillos DPBS. Bajo una campana química, añadir 500 l 4% PFA / DPBS a cada pocillo. Incubar a TA durante 10 min. Retire la PFA / DPBS y se lava 3 veces con dH2O ultrapura Deje que la placa de 24 pocillos se seque en la campana de humos. Inmunofluorescencia para marcadores MSC NOTA: La tinción de inmunofluorescencia de la OS-CSC fija en 4% PFA / DPBS se puede utilizar para investigar el fenotipo MSC-como de OS-CSC usando anticuerpos dirigidos contra CD44, Stro-1 y CD105. El siguiente método se utiliza de forma rutinaria por los autores. En una campana química, permeabilizar las células que han sido fijados en el 4% PFA / DPBS mediante la adición de 500 l 0,2% De Triton X-100 / DPBS a cada pocillo. Se incuban las células a 37 ° C durante 30 min. Lave suavemente las células 3 veces con DPBS. Añadir 300 l de RNasa diluyó 1 / 1.000 con 2% BSA / DPBS a las células y se incuba a 37 ° C durante 30 min. Lave suavemente las células 3 veces con BSA al 2% / DPBS. Teñir las células para los marcadores de MSC. Añadir el anticuerpo primario solamente a los pocillos seleccionados como controles positivos para cada anticuerpo. Añadir 300 l anti-CD105 diluyeron 1/10 con un 2% de BSA / DPBS, 300 l anti-CD44 diluye 1/10 con un 2% de BSA / DPBS, 300 l anti-Stro-1 se diluye 1/10 con un 2% de BSA / DPBS y sólo 200 l 2% de BSA / DPBS a los pozos seleccionados como controles negativos para cada anticuerpo. Se incuban las células en un ambiente húmedo a 4 ° CO / N. Lavar los pocillos 3 veces con DPBS y luego dos veces con 2% BSA / DPBS. Revelar anticuerpos primarios mediante la adición de anticuerpos secundarios específicos. Añadir 300 l de IgG anti-conejo (de burro anti-IgG de conejo [H + L]) diluido 1/100con 2% de BSA / DPBS en cada pocillo elegido como control positivo y negativo para CD44 y CD105. Añadir 300 l FITC anti-Ig de ratón (FITC-conejo anti-IgG de ratón [H + L]) diluido 1/100 con 2% BSA / DPBS en cada pocillo elegido como control positivo y negativo para Stro-1. Se incuban las células en la oscuridad a temperatura ambiente durante 60 min. Lave los pocillos de 6x con DPBS. Mancha MSC células de marcador positivo para citoesqueleto de actina mediante la adición de 300 l faloidina diluida 1/100 con 2% de BSA / DPBS en cada pocillo manchado de inmunofluorescencia MSC marcador. Se incuban las células durante 40 min a TA. Lavar los pocillos 3 veces con DPBS y luego se lavan dos veces con dH2O ultrapura Proceder a la tinción de contraste de los núcleos después de la tinción de inmunofluorescencia se ha descrito anteriormente. Preparar la solución de yoduro de propidio 10 -5 M en DPBS (acción 1.5 x 10 -3 M) en una campana de humos. Añadir 200 solución de yoduro de propidio l a cada pocillo de color como se describe anteriormente. Incubar la células para 2 – 3 min a TA. Lavar los pocillos dos veces con dH2O ultrapura NOTA: repetir todos los pasos de las secciones 5.1 – 5.2 en la HCT8 línea celular, una línea diferenciada continua primaria cáncer de colon de células que se utiliza como un control negativo. Ensayo de diferenciación osteogénica NOTA: la diferenciación osteogénica tiene una duración de 20 d. Plate OS-CSC en placas de 24 pocillos a una densidad celular de las células de 1 x 10 4 / cm 2 en SCCGM. Permitir que las células crezcan en SCGM hasta que alcanzan 80-90% de confluencia en cada pocillo. Iniciar la diferenciación osteogénica cambiando el SCGM a OM. Permiten que las células crezcan en OM y refrescar el medio cada 3 – 4 d. Detener el ensayo de diferenciación osteogénica a los 10 días para evaluar la presencia de fosfatasa alcalina (ALP). Fix células en PFA al 4% / DPBS (ver sección 5.1). Evaluar el fenotipo osteoblástico por tinción citoquímica para ALP y para HAutilizando rojo de alizarina S tinción. ALP tinción citoquímica NOTA: Preparar la mezcla de colorantes en una campana química inmediatamente antes de iniciar la tinción. Disolver 40 mg de Blue BB o sal Fast Red Violet LB en 50 ml de Tris-HCl, pH 9 (Solución A) Rápido. Disolver la sal de fosfato de sodio naftol-AS-MX 5 mg en 1 ml de DMSO (solución B). Añadir la solución B por completo a la solución A y mezclar bien, la obtención de células Solución C. Lavar dos veces con DPBS. Añadir 500 l – 1 ml de solución C a cada pocillo y se incuba a 37 ° C y 5% de CO 2. Vigilar el curso de la tinción cada 10 min mediante la observación de las células bajo el microscopio. Detener la tinción cuando las células ALP-positivos se vuelven intensamente coloreada (azul con la sal Fast Blue BB o rojo con sal LB Rojo Violeta Rápido), que generalmente se produce a los 30 minutos. Se lavan las células 3 veces con dH 2 O ultrapura para eliminar todos los residuos de la solución C. Si un precipitado de la manchos presente, se lavan las células rápidamente una vez con etanol absoluto. Proceder a la tinción de contraste de los núcleos después de la tinción de fosfatasa alcalina como se describe en los pasos 5.2.5 y 5.2.5.1. Rojo de alizarina S tinción citoquímica NOTA: Preparar la mezcla de colorantes antes de comenzar el experimento. Preparar el 2% rojo de alizarina S (2 g rojo de alizarina S en 100 ml de H2O ultrapura). Añadir 2,5% NH 3-2% rojo de alizarina S para llegar a pH 6,0. Tienda 2% de solución de rojo de alizarina S a 4 ° C. Se lavan las células una vez con DPBS. Añadir rojo de alizarina S a las células durante sólo unos pocos segundos. Lavar los pocillos con dH ultrapura 2 O para controlar el grado de tinción; Si los depósitos de HA no son intensamente coloreado, repita el paso 5.3.5.2. Detener la tinción cuando los depósitos de HA se vuelven de color rojo intenso color, que por lo general se produce dentro de unos minutos. Lavar los pocillos con ultrapura dH2O </li> la diferenciación adipogénica NOTA: Ensayo de duración depende de las líneas OS-CSC. El ensayo puede últimos 14 – 30 días. Plate OS-CSC en placas de 24 pocillos a una densidad celular de las células de 1 x 10 4 / cm 2 en SCGM. Permitir que las células crezcan en SCGM hasta que alcanzan 80-90% de confluencia en cada pocillo. Iniciar la diferenciación adipogénica cambiando el SCGM a AM. Permiten que las células crezcan en AM y refrescar la mañana dos veces a la semana. Detener el ensayo de diferenciación adipogénica cuando las vesículas lipídicas son visibles. Evaluar el fenotipo adipogénico por Oil Red O tinción de hematoxilina y tinción de contraste para los núcleos. Contratinción de hematoxilina para los núcleos NOTA: Preparar la mezcla de colorantes antes de comenzar el experimento. Preparar la solución de hematoxilina 5%, llamado Emallume Carazzi 39. Almacenar la solución a 4 ° C. Añadir Emallume Carazzi por sólo 2 min. Lavar los pocillos con ULTrâpure dH2O ensayo de CFU NOTA: Este experimento debe ser realizado por triplicado. Plate OS-CSC en 100 mm placas de Petri a una densidad celular de 450 células / cm 2 en CFUM. Se incuban las células en un 37 ° C, 5% de CO2 durante 4 semanas. Refrescar CFUM dos veces a la semana. Manchar la UFC con azul de toluidina. Contar las colonias de color utilizando un microscopio invertido. Calcula la eficiencia CFU de acuerdo con la siguiente fórmula: (número de colonias formadas / número de células sembradas) * 100. Análisis de la actividad de ALDH NOTA: ALDH actividad se ha evaluado usando un Ensayo Colorimétrico Kit ALDH Actividad en las dos líneas OS-CSC y en una línea de fibroblastos finito, que se utilizó como control negativo. Este kit cuantifica la actividad enzimática de ALDH por lectura de absorbancia a 450 nm. Todas las pruebas se han realizado por triplicado. Disociar cultivos de células de la monocapa por tripsinización (ver sección 2.2). Precipitar las células por centrifugación a 400 xg durante 5 min. Siga el protocolo del fabricante. El análisis por citometría de: NOTA: No se requieren suspensiones de células individuales para la tinción óptima de muestras de citometría de flujo. Una suspensión de células individuales deben estar preparados para cada anticuerpo a ensayar. Disociar cultivos de células de la monocapa por tripsinización (ver sección 2.2). Coloque la suspensión de células en un tubo cónico, llevar a cabo un recuento de células usando el Bürker cámara de recuento, centrifugar las células a 400 xg y resuspender en un volumen apropiado de tampón de separación para obtener una suspensión celular a una concentración final de células de 1 x 10 5 células / ml. Centrifugar la suspensión celular durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y lavar el sedimento con tampón de separación. Repita este paso dos veces. Las células de la mancha para la EMMarcadores de C (es decir, CD44, CD105 y Stro-1) 40. Analizar las suspensiones de células teñidas positivamente en un citómetro de flujo. Analizar las muestras marcadas en el plazo de 1 d. Incubar las muestras a 4 ° C hasta su análisis. RT-PCR Extracción y aislamiento de ARN Añadir reactivo de lisis 1 ml de las muestras envasadas congelados celulares de OS-CSC y lisar las células directamente en el tubo con la pipeta el sedimento arriba y abajo varias veces. Centrifugar las muestras a 12.000 xg durante 1 min a 4 ° C. Retire con cuidado el sobrenadante. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo, añadir 200 l de cloroformo, y la tapa del tubo de forma segura. Agitar el tubo vigorosamente durante 15 segundos e incubar la muestra durante 5 min a TA. Centrifugar las muestras a 12.000 xg durante 15 min a 4 ° C. La mezcla se separa en tres fases diferentes. El ARN es exclusivamente en la fase acuosa superior incolora. siendo particularly cuidado, sólo eliminar la fase acuosa y la transferencia de esta fase en un nuevo tubo para proceder con el aislamiento de ARN. Añadir 500 l de isopropanol al tubo que contiene la fase acuosa. Agitar suavemente con la mano. Incubar la muestra a la temperatura ambiente durante 10 min. Centrifugar la muestra a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C. NOTA: Después se centrifuga la muestra, es posible ver el ARN, que forma un gránulo similar a un gel en el lado y en la parte inferior del tubo. Eliminar el sobrenadante del tubo, teniendo cuidado de dejar el pellet de ARN en la parte inferior. Añadir 1 ml de etanol 75% al ​​tubo. Vortex el tubo con la mano durante unos pocos segundos y centrifugar el tubo a 7500 × g durante 5 min a 4 ° C. Desechar el etanol y secar al aire el precipitado de ARN. Cuando la pastilla es seco, resuspender el sedimento de ARN en RNasa libre de agua (10 – 50 l) pipeteando la solución hacia arriba y abajo varias veces. Determinar el rendimiento y la pureza del ARN por measurante la absorbancia a 260 nm y 280 nm usando un espectrofotómetro. Evaluar la integridad del ARN total sobre gel de agarosa estándar 1%. Almacenar el ARN a -80 ° C. Reacción en cadena de la polimerasa Sintetizar ADNc de primera cadena a partir de 500 ng muestras de ARN utilizando un kit de transcripción inversa. Descongelar las muestras de ARN en el hielo y el deshielo de las soluciones necesarias incluidas en el kit a temperatura ambiente. Proceder para sintetizar ADNc siguientes protocolo del fabricante. Semi-cuantitativa reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) Llevar a cabo todas las PCR utilizando 1 l de ADNc para cada muestra como una plantilla en un volumen final de reacción de 24 l. Utilice las secuencias de los cebadores listados en la Tabla 1 para la amplificación de Nanog, Oct 3/4, SOX2 y CD133 genes. Separar los productos de RT-PCR mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,8% y tinción con bromuro de etidio. Fotografía obtenida con Illum UVminación.