Dette arbeidet beskriver en in vitro differensiering protokollen til å produsere pigmenterte, modne melanocytter fra menneskelige pluripotente stamceller via en neural crest og melanoblast mellomstadium ved hjelp av en mater-fri, 25 dagers protokollen.
Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.
Menneskelige pluripotente stamceller (hPSCs) gi en plattform for å etterligne normal differensiering i en skalerbar mote for sykdom modellering, narkotika screening, og celle erstatning terapi 1-6. Av spesiell interesse, hPSCs åpne opp muligheter for å studere vanskelig å isolere eller sjeldne / forbigående celletyper hvor pasientprøver er knappe. Videre induserte pluripotente stamceller (iPSCs) gjør forskerne å studere utvikling og sykdom modellering i en pasient bestemt måte å løse unike mekanismer 1,2,7-11. Den tidligere utgitt protokoll for differensiering av melanocytter fra hPSCs krever opp til 6 uker med differensiering og innebærer dyrking celler med kondisjonert medium fra L-Wnt3a celler 12. Protokollen først presentert av Mica et al. Og beskrevet her produserer pigmenterte celler i tre uker, og fjerner tvetydighet og uoverensstemmelser i forbindelse med kondisjonert medium.
melanocytter are avledet fra neural crest, en vandrende populasjon av celler som er unike for virveldyr. Neural crest er definert under gastrulation og representerer en populasjon av celler ved kanten av det nevrale plate, som grenser mellom det neurale og ikke-nevrale ektoderm. Under neurulation, utvikler den nervevev fra et neural-plate for å danne nevrale folder, som konvergerer ved dorsal midtlinjen som resulterer i det nevrale rør 13,14.
Neural crest cellene skilles ut fra taket plate av nevralrøret, på motsatt side av ryggstreng, og gjennomgår en epitelial til mesenchymale overgang før den vandrer bort for å gi opphav til en mangfoldig befolkning av differensierte celler. Skjebnen av toppen celler er definert delvis av den anatomiske plassering av taket platen langs kroppens akse for embryoet. Neural crest celle derivater omfatter linjer karakteristisk for både mesoderm (glatte muskelceller, osteoblaster, adipocytter, chondrocytes) og ektoderm celler (melanocytter, Schwann calen, nevroner) 14. Nevrale kløft stamceller oppregulere transkripsjonsfaktor SOX10 og kan isoleres ved fluorescens-aktivert cellesortering med antistoffer mot p75 og HNK1.
Neural crest cellene skjebnebestemt til å bli melanocytter passere gjennom en melanoblast scenen og oppregulere KIT og MITF (mikroftalmi-assosiert transkripsjonsfaktor) 6,21 MITF er en mester regulator av melanocyte utvikling og er en transkripsjonsfaktor ansvarlig for å kontrollere mye av melanocytter utvikling 22- 24. Menneske melanoblasts migrere til basal laget av epidermis hvor de bor enten i håret kul eller omgitt av keratinocytter i epidermis (forming pigmentering enheter) å tjene som forløpere for de modne, pigmenterte melanocytter. Differensiering og modning av melanoblasts inn i pigmenterte melanocytter opptrer samtidig med kolonisering av hår pære og ekspresjon av melaninproduksjonen pathway (TYRP1, TYR, og OCA2PMEL) 25,26.
Isolere menneskelige melanocytter og melanoblasts fra pasienter er dyrt, vanskelig og begrensende i kvantitet. Denne protokollen gjør det mulig for forskere å skille hPSCs (indusert eller embryonale) i melanocytter eller melanocyte forløpere i en veldefinert, rask, reproduserbar, skalerbar og billig metode uten cellesortering. Protokollen ble brukt tidligere for å identifisere sykdomsspesifikke feil når differensiere iPSCs fra pasienter med pigmentforstyrrelser.
For vellykket differensiering av melanocytter fra hPSCs bør tas i betraktning følgende forslag. Først og fremst er det viktig å arbeide under sterile dyrkningsbetingelser til enhver tid. I tillegg er det viktig å starte med pluripotent, fullt udifferensiert hPSCs; hvis utgangspopulasjon inneholder differensierte celler utbyttet vil alltid falle som forurensningene ikke kan rettes mot melanocytter, og kan til og med ytterligere forstyrre skikkelig differensierende celler.
For å sikre ce…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av et fellesskap for melanom forskere fra Joanna M. Nicolay Foundation og av National Institutes of Health i henhold til Ruth L. Kirschstein National Research Service Award F31. Dette arbeidet ble også støttet gjennom tilskudd fra NYSTEM og Tri-institusjonelle stamcelle initiativ (Starr Foundation).
Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
apo human transferrin | Sigma | T1147 | |
Ascorbic Acid (L-AA) | Sigma | A4034 | 100 mM |
B27 (B27 Supplement) | Invitrogen | 17504044 | |
β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 10 mg/ml |
BMP4 | R&D Systems | 314-bp | |
CHIR99021 | Tocris-R&D Systems | 4423 | 6 mM |
Cholera toxin | Sigma | C8052 | 50 mg/ml |
cAMP (cyclicAMP) | Sigma | D0627 | 100 mM |
Dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | 50 μM |
DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco-Life Technologies | 11985-092 | |
DMEM/F12 – Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Life Technologies | 1133–032 | |
DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
EDN3 (Endothelin-3, human) | American Peptide Company | 88-5-10B | 100 μM |
Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | 200 μg/ml |
gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | 0.1% in PBS | |
Glucose | Sigma | G7021 | |
Human insulin | Sigma | I2643 | |
ITS+ Universal Culture Supplement Premix | BD Biosciences | 354352 | |
KSR (Knockout Serum Replacement) | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | |
Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | 100 mM |
Low glucose DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | Dissolve 1:20 in DMEM/F12 |
MCDB201 Medium | Sigma | M6770 | |
MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-080 | |
Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-8105M | |
Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | 1 mg/ml |
Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
Penicilin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/ml |
Poly-L Omithin hydrobromide | Sigma | P3655 | 15 mg/ml |
Progesterone | Sigma | P8783 | 0.032g in 100ml 100% ethanol |
Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
FGF2 (Recombinant human FGF basic) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | 10 mg/ml |
SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1814 | 10 mM |
Selenite | Sigma | S5261 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
SCF (Stem Cell Factor, recombinant Human) | Peprotech Inc. | 300-07 | 50 μg/ml |
TYRP1 (G-17) Antibody | Santa Cruz | 10443 | 1:200 |
TYRP2 Antibody | Abcam | 74073 | 1:200 |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | 10 mM |