Feeder-свободный Вывод меланоцитов из человеческих плюрипотентные стволовые клетки
Summary
Эта работа описывает протокол дифференцировки в пробирке для производства пигментных, зрелые меланоциты из человеческих плюрипотентных стволовых клеток с помощью нервного гребня и меланобластов промежуточную стадию с использованием фидерных бесплатно, 25 день протокола.
Abstract
Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.
Introduction
Человеческие плюрипотентные стволовые клетки (hPSCs) обеспечивают платформу для имитации нормальной дифференцировки в масштабируемой моды для моделирования болезней, скрининга лекарственных средств и клеточной заместительной терапии 1-6. Особый интерес, hPSCs открывают возможности для изучения трудно выделить или редкие / переходные типы клеток, где образцы пациентов скудны. Кроме того, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) позволяют исследователям изучать развитие и моделирования заболевания у пациента специфическим образом , чтобы раскрыть уникальные механизмы 1,2,7-11. Ранее опубликована протокол для дифференциации меланоцитов от hPSCs требуется до 6 недель дифференцировок и включает в себя культивирование клеток с кондиционированной средой из L-WNT3a клеток 12. Протокол первый представленный слюды и др. И описано здесь производит пигментные клетки в течение трех недель и устраняет неоднозначность и несоответствий , связанных с кондиционированной средой.
меланоциты сотоке происходит от нервного гребня, миграционным популяции клеток, уникальных для позвоночных. Нервный гребень определяется во время гаструляции и представляет собой популяцию клеток у края нервной пластинки, на границе между нервной и не-нейральной эктодермы. Во время нейруляции, нервная ткань развивается из нервной пластинки с образованием нервных складок, которые сходятся на средней линии спины приводит к 13,14 нервной трубки.
В клетки нервного гребня возникают из потолочной панели нервной трубки, напротив хорды, и пройти эпителиальные к мезенхимальных перехода перед миграцией в сторону, чтобы дать начало различных слоев населения дифференцированных клеток. Судьбы клеток гребня определяются частично анатомическим расположением крыши пластины вдоль оси тела зародыша. Нервные производные гребень клеток включают родословные, характерные как мезодермы (гладкие мышечные клетки, остеобласты, адипоциты, хондроциты) и эктодермы клетки (меланоциты, Шванн сгезов, нейроны) 14. Нервный гребень стволовые клетки апрегулируются фактор транскрипции Sox10 и может быть выделен с помощью флуоресцентной активированные клетки сортировочного с антителами к р75 и HNK1.
В клетки нервного гребня суждено стать меланоциты пройти через стадию меланобластов и апрегулируются KIT и MITF (микрофтальмия-ассоциированный фактор транскрипции) 6,21 MITF является главный регулятор развития меланоцитов и является фактором транскрипции отвечает за контроль большую часть развития меланоцитов 22- 24. Человеческие меланобластов мигрируют в базальный слой эпидермиса, где они проживают либо в выпуклость волос или окружены кератиноцитов в эпидермисе (образуя пигментные единиц), чтобы служить в качестве предшественников зрелых, пигментных меланоцитов. Дифференцировку и созревание меланобластов в пигментированных меланоцитов происходит одновременно с колонизацией волосяной луковицы и экспрессии продуцирование меланина пути (TYRP1, Tyr, oca2 иПМЕЛ) 25,26.
Разделительный меланоцитов человека и меланобластов от больных является дорогостоящим, трудным и ограничение в количестве. Этот протокол позволяет исследователям дифференцировать hPSCs (беременными или эмбриональные) в меланоцитов или меланоцитов предшественников в четко определенной, быстрой, воспроизводимой, масштабируемой и недорогим способом без сортировки клеток. Протокол был использован ранее для выявления конкретных заболеваний дефектов при дифференцировании иПСК от пациентов с нарушениями пигментации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для успешной дифференциации меланоцитов из hPSCs следующие предложения должны быть приняты во внимание. В первую очередь, необходимо работать в стерильных условиях культивирования во все времена. Кроме того, важно, чтобы начать с плюрипотентных полностью недифференцированных hPSCs; если ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана стипендии для меланомы исследователей из Joanna M. Nicolay Foundation и Национальным институтом здоровья под Рут Л. Kirschstein Национальный исследовательский премии Сервис F31. Эта работа была дополнительно поддерживается за счет субсидий из NYSTEM и инициативы Tri-институциональном стволовых клеток (Starr Foundation).
Materials
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| apo human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Ascorbic Acid (L-AA) | Sigma | A4034 | 100 mM |
| B27 (B27 Supplement) | Invitrogen | 17504044 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 10 mg/ml |
| BMP4 | R&D Systems | 314-bp | |
| CHIR99021 | Tocris-R&D Systems | 4423 | 6 mM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | 50 mg/ml |
| cAMP (cyclicAMP) | Sigma | D0627 | 100 mM |
| Dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | 50 μM |
| DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco-Life Technologies | 11985-092 | |
| DMEM/F12 – Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Life Technologies | 1133–032 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| EDN3 (Endothelin-3, human) | American Peptide Company | 88-5-10B | 100 μM |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | 200 μg/ml |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | 0.1% in PBS | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Human insulin | Sigma | I2643 | |
| ITS+ Universal Culture Supplement Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| KSR (Knockout Serum Replacement) | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | 100 mM |
| Low glucose DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | Dissolve 1:20 in DMEM/F12 |
| MCDB201 Medium | Sigma | M6770 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-080 | |
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-8105M | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | 1 mg/ml |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Poly-L Omithin hydrobromide | Sigma | P3655 | 15 mg/ml |
| Progesterone | Sigma | P8783 | 0.032g in 100ml 100% ethanol |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| FGF2 (Recombinant human FGF basic) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | 10 mg/ml |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1814 | 10 mM |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| SCF (Stem Cell Factor, recombinant Human) | Peprotech Inc. | 300-07 | 50 μg/ml |
| TYRP1 (G-17) Antibody | Santa Cruz | 10443 | 1:200 |
| TYRP2 Antibody | Abcam | 74073 | 1:200 |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | 10 mM |
Referências
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat methods. 7, 25-27 (2010).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ health persp. 120, 1116-1122 (2012).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell rep. 3, 1140-1152 (2013).
- Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
- Doulatov, S., et al. Modeling Diamond Blackfan Anemia in Vivo Using Human Induced Pluripotent Stem Cells. Blood. 124, (2014).
- Cherry, A. B. C., Daley, G. Q. Reprogrammed Cells for Disease Modeling and Regenerative Medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
- Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. Embo J. 33, 409-417 (2014).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494, 105-110 (2013).
- Fang, D., et al. Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells. Stem cells. 24, 1668-1677 (2006).
- Huang, X., Saint-Jeannet, J. P. Induction of the neural crest and the opportunities of life on the edge. Dev biol. 275, 1-11 (2004).
- White, R. M., Zon, L. I. Melanocytes in development, regeneration, and cancer. Cell stem cell. 3, 242-252 (2008).
- Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
- Elworthy, S., Pinto, J. P., Pettifer, A., Cancela, M. L., Kelsh, R. N. Phox2b function in the enteric nervous system is conserved in zebrafish and is sox10-dependent. Mech develop. 122, 659-669 (2005).
- Harris, M. L., Baxter, L. L., Loftus, S. K., Pavan, W. J. Sox proteins in melanocyte development and melanoma. Pigm cell melanoma r. 23, 496-513 (2010).
- Herbarth, B., et al. Mutation of the Sry-related Sox10 gene in Dominant megacolon, a mouse model for human Hirschsprung disease. PNAS. 95, 5161-5165 (1998).
- Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nat genetics. 18, 60-64 (1998).
- Dupin, E., Glavieux, C., Vaigot, P., Le Douarin, N. M. Endothelin 3 induces the reversion of melanocytes to glia through a neural crest-derived glial-melanocytic progenitor. PNAS. 97, 7882-7887 (2000).
- Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126, 3757-3767 (1999).
- Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF. Development. 127, 5379-5389 (2000).
- Levy, C., Khaled, M., Fisher, D. E. MITF: master regulator of melanocyte development and melanoma oncogene. Trends mol med. 12, 406-414 (2006).
- Phung, B., Sun, J., Schepsky, A., Steingrimsson, E., Ronnstrand, L. C-KIT signaling depends on microphthalmia-associated transcription factor for effects on cell proliferation. PloS one. 6, e24064 (2011).
- Grichnik, J. M., et al. KIT expression reveals a population of precursor melanocytes in human skin. J invest dermatol. 106, 967-971 (1996).
- Li, L., et al. Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes. J cell sci. 123, 853-860 (2010).
- Nishimura, E. K., et al. Dominant role of the niche in melanocyte stem-cell fate determination. Nature. 416, 854-860 (2002).
- Zur Nieden, N. I. . Embryonic stem cell therapy for osteo-degenerative diseases : methods and protocols. , (2011).
- Lee, J. H., et al. high-content screening for novel pigmentation regulators using a keratinocyte/melanocyte co-culture system. Exp dermatol. 23, 125-129 (2014).
