Dette arbejde beskriver en in vitro differentiering protokol til at producere pigmenterede, modne melanocytter fra humane pluripotente stamceller via en neural crest og melanoblast mellemtrin ved hjælp af en feeder-fri, 25 dage protokol.
Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.
Humane pluripotente stamceller (hPSCs) skabe en platform til at efterligne normal differentiering i en skalerbar mode for sygdom modellering, narkotika screening, og celle udskiftning behandlingsformer 1-6. Af særlig interesse, hPSCs åbner muligheder for at studere vanskeligt at isolere eller sjældne / forbigående celletyper hvor patientprøver er knappe. Endvidere inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) gøre det muligt for forskerne at studere udviklingen og sygdom modellering i en patient specifik måde at optrævle unikke mekanismer 1,2,7-11. Den tidligere offentliggjort protokol til differentiering af melanocytter fra hPSCs kræver op til 6 ugers opdelinger og involverer dyrkning af celler med konditioneret medium fra L-Wnt3a celler 12. Protokollen først præsenteret af Mica et al. Og beskrevet her producerer pigmenterede celler i tre uger, og fjerner den uklarhed og uoverensstemmelser i forbindelse med konditioneret medium.
melanocytter are afledt af crista neuralis, en vandrende population af celler unikke for hvirveldyr. Den neurale crest er defineret under gastrulation og repræsenterer en population af celler på kanten af det neurale plade, der grænser mellem neurale og ikke-neurale ektoderm. Under neurulation, nervevævet udvikler sig fra et neuralt plade til dannelse af neurale folder, der løber sammen i den dorsale midtlinje resulterer i neuralrøret 13,14.
Crista neuralis celler forlader toppladen af det neurale rør, overfor rygstrengen, og undergår en epitelial til mesenkymale overgang før strømme væk for at give anledning til en forskelligartet population af differentierede celler. Skæbner de kamceller er defineret delvist af den anatomiske placering af tagpladen langs legemet akse af embryonet. Neuralkam cellederivater omfatter slægter karakteristiske for både mesoderm (glatte muskelceller, osteoblaster, adipocytter, chondrocytter) og ektoderm celler (melanocytter, Schwann calen, neuroner) 14. Neurale crest stamceller opregulerer transskriptionsfaktoren SOX10 og kan isoleres ved fluorescensaktiveret cellesortering med antistoffer til p75 og HNK1.
De neurale kamceller skæbnesvangre at blive melanocytter passere gennem en melanoblast scene og opregulere KIT og MITF (mikroftalmia-associeret transkriptionsfaktor) 6,21 MITF er en master regulator af melanocyt udvikling og er en transkriptionsfaktor ansvarlig for kontrollen meget af melanocyt udvikling 22- 24. Humane melanoblasts migrere til det basale lag af epidermis, hvor de bor enten i håret bule eller omgivet af keratinocytter i epidermis (dannende pigmentering enheder) til at tjene som forløbere for de modne, pigmenterede melanocytter. Differentieringen og modning af melanoblasts i pigmenterede melanocytter sker samtidig med kolonisering af hår pære og udtryk for melanin produktionen vejen (TYRP1, TYR, OCA2 ogPmel) 25,26.
Isolering humane melanocytter og melanoblasts fra patienter er dyrt, vanskeligt og begrænsende mængde. Denne protokol giver forskerne til at differentiere hPSCs (induceret eller embryonale) i melanocytter eller melanocyt forstadier i et veldefineret, hurtig, reproducerbar, skalerbar og billig metode uden celle sortering. Protokollen blev brugt tidligere til at identificere sygdomsspecifikke defekter når differentiere iPSCs fra patienter med pigmentering lidelser.
For en vellykket differentiering af melanocytter fra hPSCs bør tages hensyn til følgende forslag. Først og fremmest er det vigtigt at arbejde under sterile dyrkningsbetingelser på alle tidspunkter. Desuden er det vigtigt at starte med pluripotent, fuldt udifferentierede hPSCs; hvis startpopulationen indeholder differentierede celler udbyttet vil uvægerligt falde som forureningerne ikke kan rette sig mod melanocytter og kan endda yderligere forstyrre korrekt differentierende celler.
For …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af et stipendium for melanom forskere fra Joanna M. Nicolay Foundation og National Institutes of Health i henhold Ruth L. Kirschstein National Research Service Award F31. Dette arbejde blev yderligere understøttet gennem tilskud fra NYSTEM og Tri-institutionelle stamcelle-initiativet (Starr Foundation).
Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
apo human transferrin | Sigma | T1147 | |
Ascorbic Acid (L-AA) | Sigma | A4034 | 100 mM |
B27 (B27 Supplement) | Invitrogen | 17504044 | |
β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 10 mg/ml |
BMP4 | R&D Systems | 314-bp | |
CHIR99021 | Tocris-R&D Systems | 4423 | 6 mM |
Cholera toxin | Sigma | C8052 | 50 mg/ml |
cAMP (cyclicAMP) | Sigma | D0627 | 100 mM |
Dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | 50 μM |
DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco-Life Technologies | 11985-092 | |
DMEM/F12 – Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Life Technologies | 1133–032 | |
DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
EDN3 (Endothelin-3, human) | American Peptide Company | 88-5-10B | 100 μM |
Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | 200 μg/ml |
gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | 0.1% in PBS | |
Glucose | Sigma | G7021 | |
Human insulin | Sigma | I2643 | |
ITS+ Universal Culture Supplement Premix | BD Biosciences | 354352 | |
KSR (Knockout Serum Replacement) | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | |
Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | 100 mM |
Low glucose DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | Dissolve 1:20 in DMEM/F12 |
MCDB201 Medium | Sigma | M6770 | |
MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-080 | |
Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-8105M | |
Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | 1 mg/ml |
Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
Penicilin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/ml |
Poly-L Omithin hydrobromide | Sigma | P3655 | 15 mg/ml |
Progesterone | Sigma | P8783 | 0.032g in 100ml 100% ethanol |
Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
FGF2 (Recombinant human FGF basic) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | 10 mg/ml |
SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1814 | 10 mM |
Selenite | Sigma | S5261 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
SCF (Stem Cell Factor, recombinant Human) | Peprotech Inc. | 300-07 | 50 μg/ml |
TYRP1 (G-17) Antibody | Santa Cruz | 10443 | 1:200 |
TYRP2 Antibody | Abcam | 74073 | 1:200 |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | 10 mM |