Detta arbete beskriver ett in vitro differentiering protokoll för att producera pigmente, mogna melanocyter från humana pluripotenta stamceller via en neural crest och melanoblast mellansteg med hjälp av en matarfria, 25 dagars protokoll.
Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.
Humana pluripotenta stamceller (hPSCs) tillhandahålla en plattform för att efterlikna normal differentiering i en skalbar mode för sjukdom modellering, drug screening och cellersättningsterapi 1-6. Av särskilt intresse, hPSCs öppnar vägar för att studera svåra att isolera eller sällsynta / gående celltyper där patientprover är knappa. Vidare inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) göra det möjligt för forskare att studera utveckling och sjukdom modellering i en patient specifikt sätt att riva unika mekanismer 1,2,7-11. Det tidigare publicerade protokoll för differentiering av melanocyter från hPSCs kräver upp till 6 veckor av differentieringar och involverar odling av celler med konditionerat medium från L-Wnt3a cellerna 12. Protokollet först presenterades av Mica et al. Och beskrivs här producerar pigmenterade celler i tre veckor och tar bort den tvetydighet och inkonsekvenser i samband med konditionerat medium.
melanocyter are härrör från neural crest, en vandrande population av celler som är unika för ryggradsdjur. Neurallisten definieras under gastrulation och representerar en population av celler vid kanten av det neurala plattan, som gränsar mellan neurala och icke-neurala ektoderm. Under neurulation, utvecklas nervvävnad från ett neuralt platta för att bilda neurala veck, som konvergerar vid ryggens mittlinje resulterar i neuralröret 13,14.
Neurallisten celler ta sig ur takplåten av neuralröret, mittemot notochord, och genomgår en epitelial till mesenkymala övergång innan den vandrar bort för att ge upphov till en mångskiftande population av differentierade celler. Öden de crest celler definieras delvis av den anatomiska lokaliseringen av takplåten längs kroppsaxeln hos embryot. Neurallisten cellderivat inkluderar härstamningar som är karakteristiska för både mesoderm (glatta muskelceller, osteoblaster, adipocyter, kondrocyter) och ektoderm celler (melanocyter, Schwann calnar, neuroner) 14. Neurallisten stamceller uppreglera transkriptionsfaktom SOX10 och kan isoleras genom fluorescensaktiverad cellsortering med antikroppar mot p75 och HNK1.
Neurallisten celler ödesbestämd att bli melanocyter passera genom en melanoblast scen och uppreglera KIT och MITF (mikroftalmi-associerad transkriptionsfaktor) 6,21 MITF är en mästare regulator av melanocyt utveckling och är en transkriptionsfaktor som ansvarar för att kontrollera en stor del av melanocyt utveckling 22- 24. Mänskliga melanoblasts migrera till basalskiktet av epidermis där de bor antingen i håret bula eller omgiven av keratinocyter i epidermis (som bildar pigmente enheter) för att tjäna som föregångare till den mogna, pigmenterade melanocyter. Differentieringen och mognad av melanoblasts i pigmenterade melanocyter sker samtidigt med koloniseringen av hårsäcken och uttryck av melanin produktionskedja (TYRP1, TYR, OCA2 ochPMEL) 25,26.
Isolera humana melanocyter och melanoblasts från patienter är dyrt, svårt och begränsande i kvantitet. Detta protokoll gör det möjligt för forskare att skilja hPSCs (inducerad eller embryonala) i melanocyter eller melanocytstimulerande prekursorer i en väl definierad, snabb, reproducerbar, skalbar och billig metod utan cellsortering. Protokollet användes tidigare för att identifiera sjukdomsspecifika brister när differentiera iPSCs från patienter med pigmentstörningar.
För framgångsrik differentiering av melanocyter från hPSCs följande förslag bör beaktas. Först och främst är det viktigt att arbeta under sterila odlingsbetingelser vid alla tillfällen. Dessutom är det viktigt att börja med pluripotenta, fullt odifferentierade hPSCs; om utgångspopulationen innehåller differentierade celler utbytet kommer alltid sjunka eftersom föroreningarna inte kan riktas mot melanocyter och kan även ytterligare störa korrekt differentierande cellerna.
Fö…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av ett stipendium för melanom forskare från Joanna M. Nicolay Foundation och av National Institutes of Health enligt Ruth L. Kirschstein National Research Service Award F31. Detta arbete stöddes ytterligare genom bidrag från NYSTEM och Tri-institutionella stamcells initiativ (Starr Foundation).
Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
apo human transferrin | Sigma | T1147 | |
Ascorbic Acid (L-AA) | Sigma | A4034 | 100 mM |
B27 (B27 Supplement) | Invitrogen | 17504044 | |
β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 10 mg/ml |
BMP4 | R&D Systems | 314-bp | |
CHIR99021 | Tocris-R&D Systems | 4423 | 6 mM |
Cholera toxin | Sigma | C8052 | 50 mg/ml |
cAMP (cyclicAMP) | Sigma | D0627 | 100 mM |
Dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | 50 μM |
DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco-Life Technologies | 11985-092 | |
DMEM/F12 – Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Life Technologies | 1133–032 | |
DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
EDN3 (Endothelin-3, human) | American Peptide Company | 88-5-10B | 100 μM |
Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | 200 μg/ml |
gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | 0.1% in PBS | |
Glucose | Sigma | G7021 | |
Human insulin | Sigma | I2643 | |
ITS+ Universal Culture Supplement Premix | BD Biosciences | 354352 | |
KSR (Knockout Serum Replacement) | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | |
Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | 100 mM |
Low glucose DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | Dissolve 1:20 in DMEM/F12 |
MCDB201 Medium | Sigma | M6770 | |
MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-080 | |
Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-8105M | |
Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | 1 mg/ml |
Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
Penicilin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/ml |
Poly-L Omithin hydrobromide | Sigma | P3655 | 15 mg/ml |
Progesterone | Sigma | P8783 | 0.032g in 100ml 100% ethanol |
Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
FGF2 (Recombinant human FGF basic) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | 10 mg/ml |
SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1814 | 10 mM |
Selenite | Sigma | S5261 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
SCF (Stem Cell Factor, recombinant Human) | Peprotech Inc. | 300-07 | 50 μg/ml |
TYRP1 (G-17) Antibody | Santa Cruz | 10443 | 1:200 |
TYRP2 Antibody | Abcam | 74073 | 1:200 |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | 10 mM |