この作品は、神経堤を介したヒト多能性幹細胞から色素沈着し、成熟したメラノサイトを生成し、無フィーダー、25日のプロトコルを使用して中間段階のメラノブラストするためのin vitroでの分化プロトコルを記述します。
Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.
ヒト多能性幹細胞(hPSCs)は、疾患モデル、薬物スクリーニング、および細胞置換療法1-6のためのスケーラブルな方法で正常な分化を模倣するためのプラットフォームを提供します。特に興味深いのは、hPSCsは、患者のサンプルが不足している単離することが困難またはまれ/一過性の細胞型を研究するための道を開きます。また、人工多能性幹細胞(性IPSC)のユニークなメカニズム1,2,7-11を解明するために、患者特異的に開発し、疾患モデルを研究する研究者を有効にします。 hPSCsからメラノサイトの分化のための以前に公開されたプロトコルは、分化の6週間まで必要とし、L-のWnt3a細胞12からの馴化培地で細胞を培養することを含みます。 1プロトコル第1雲母らによって提示。、ここでは説明は3週間で色素沈着細胞を生成し、馴化培地に関連した曖昧さや矛盾を削除します。
メラノサイトのareは神経堤、脊椎動物に特有の細胞の遊走集団から派生します。神経堤は、原腸陥入時に定義され、神経および非神経外胚葉の間で国境を接する、神経板のエッジで細胞の集団を表しています。神経胚形成の間に、神経組織が 神経管13,14の結果背側正中線に収束神経ひだを形成するために、神経板から進化します。
神経堤細胞は脊索の向かい、神経管の屋根板から出て、分化した細胞の多様な集団を生じさせるために離れて移行する前に、間葉への移行上皮を受けます。堤細胞の運命は、胚の体軸に沿って屋根板の解剖学的位置によって部分的に定義されています。神経堤細胞誘導体は、中胚葉(平滑筋細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞)および外胚葉細胞(メラノサイト、シュワンCの両方の特性系統を含みますells、ニューロン)14。神経堤幹細胞は、転写因子SOX10をアップレギュレートおよびp75とHNK1に対する抗体を用いて蛍光活性化セルソーティングにより単離することができます。
メラノサイトになることを運命づけられた神経堤細胞は、メラノブラストのステージを通過し、KITとMITF(小眼球症関連転写因子)をアップレギュレート6,21 MITFは、メラニン細胞の開発のマスター調節因子であり、メラノサイトの開発の多くを制御する役割を担う転写因子であります22- 24。人間melanoblastsは、彼らが毛膨らみまたは表皮中のケラチノサイトに囲まれた成熟した、色素性メラノサイトの前駆体として機能する(色素形成単位)のいずれかに存在し、表皮の基底層に移行します。色素性メラノサイトへのmelanoblastsの分化・成熟は、メラニン産生経路(TYRP1、TYR、OCA2の毛球と表現の植民地とそれに付随し発生し、PMEL)25,26。
患者からのヒトメラノサイトとmelanoblastsを分離すると、高価な困難や量に制限です。このプロトコルは、細胞選別せずに明確に定義され、迅速な、再現可能なスケーラブル、かつ安価な方法でメラノサイトまたはメラノサイト前駆体にhPSCsを(誘起または胚)を区別するために研究者を可能にします。プロトコルは、色素異常症を有する患者からのiPS細胞の分化時に疾患特異的な欠陥を識別するために以前に使用されました。
hPSCsからメラノサイトの成功の分化のために以下の提案を考慮に入れなければなりません。何よりもまず、常に無菌培養条件下で動作することが不可欠です。さらに、多能性、完全未分化hPSCsで開始することが重要です。出発集団は、分化した細胞が含まれている場合、収率は常に汚染物質がメラノサイトに向けることができず、さらに適切に分化する細胞を破壊し得るよう低下します。
…The authors have nothing to disclose.
この作品は、ジョアンナM.ニコライ財団からのメラノーマ研究者のためのフェローシップによってルースL.キルシュシュタイン国立研究サービス賞F31下の国立衛生研究所によってサポートされていました。この作品は、さらにNYSTEMからの助成金やトライ機関幹細胞イニシアチブ(スター基金)を通じてサポートされていました。
Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
apo human transferrin | Sigma | T1147 | |
Ascorbic Acid (L-AA) | Sigma | A4034 | 100 mM |
B27 (B27 Supplement) | Invitrogen | 17504044 | |
β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 10 mg/ml |
BMP4 | R&D Systems | 314-bp | |
CHIR99021 | Tocris-R&D Systems | 4423 | 6 mM |
Cholera toxin | Sigma | C8052 | 50 mg/ml |
cAMP (cyclicAMP) | Sigma | D0627 | 100 mM |
Dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | 50 μM |
DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco-Life Technologies | 11985-092 | |
DMEM/F12 – Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Life Technologies | 1133–032 | |
DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
EDN3 (Endothelin-3, human) | American Peptide Company | 88-5-10B | 100 μM |
Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | 200 μg/ml |
gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | 0.1% in PBS | |
Glucose | Sigma | G7021 | |
Human insulin | Sigma | I2643 | |
ITS+ Universal Culture Supplement Premix | BD Biosciences | 354352 | |
KSR (Knockout Serum Replacement) | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | |
Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | 100 mM |
Low glucose DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | Dissolve 1:20 in DMEM/F12 |
MCDB201 Medium | Sigma | M6770 | |
MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-080 | |
Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-8105M | |
Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | 1 mg/ml |
Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
Penicilin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/ml |
Poly-L Omithin hydrobromide | Sigma | P3655 | 15 mg/ml |
Progesterone | Sigma | P8783 | 0.032g in 100ml 100% ethanol |
Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
FGF2 (Recombinant human FGF basic) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | 10 mg/ml |
SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1814 | 10 mM |
Selenite | Sigma | S5261 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
SCF (Stem Cell Factor, recombinant Human) | Peprotech Inc. | 300-07 | 50 μg/ml |
TYRP1 (G-17) Antibody | Santa Cruz | 10443 | 1:200 |
TYRP2 Antibody | Abcam | 74073 | 1:200 |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | 10 mM |