עבודה זו מתארת פרוטוקול בידול במבחנה לייצר מלנוציטים פיגמנט, מתאי גזע אנושיים pluripotent באמצעות רכס עצבי ואת melanoblast שלב ביניים באמצעות פרוטוקול מזין ללא, 25 יום.
Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.
תאי גזע פלוריפוטנטיים אדם (hPSCs) לספק פלטפורמה לחקות בידול נורמלי להרחבת אופנת דוגמנות מחלה, הקרנת סמים, וטיפולי התחדשות תאי 1-6. מעניין במיוחד, hPSCs לפתוח אפיקים ללימוד קשה לבודד או נדירים / סוגי תאים חולפים שבו דגימות חולות הן נדירות. יתר על כן, תאי גזע מושרים (iPSCs) לאפשר לחוקרים ללמוד פיתוח מודלי מחלה באופן ספציפי לחולה לפענח מנגנונים ייחודיים 1,2,7-11. הפרוטוקול שפורסם בעבר לבידול של מלנוציטים מ hPSCs דורש עד 6 שבועות של בידול כרוך תאים culturing עם בינוני מותנה מתאי L-Wnt3a 12. הפרוטוקול מובא לראשונה על ידי מיכה et al. ותאר כאן מייצר תאי פיגמנט בשלושה שבועות ומסיר את העמימות וחוסר עקביות הקשורים בינוני מותנה.
מלנוציטים arדואר נגזר הרכס העצבי, אוכלוסיית נדידה של תאים ייחודיים בעלי חוליות. הרכס העצבי מוגדר במהלך gastrulation ומייצג אוכלוסייה של תאים בקצה ההצלחה העצבית, גובל בין עצביים האאקטודרם שאינם עצביים. במהלך neurulation, רקמת העצבים מתפתחת מתוך צלחת עצבית כדי ליצור קפלים עצביים, אשר מתכנסים על קו אמצע הגב וכתוצאה מכך 13,14 בצינור העצבי.
התאים הרכס העצבי לצאת מהצלחת הגג של הצינור העצבי, מול notochord, ו לעבור אפיתל המעבר mesenchymal לפני נודדות הרחק להצמיח אוכלוסיה מגוונת של תאים מובחנים. גורלן של תאי הרכס מוגדר בחלקו על ידי המיקום אנטומי של צלחת הגג לאורך ציר הגוף של העובר. נגזר תאי רכס עצבי כולל שושלות אופייניות הוא mesoderm (תאי שריר חלק, osteoblasts, adipocytes, chondrocytes) ותאי האאקטודרם (מלנוציטים, ג שוואןאמות, נוירונים) 14. תאי גזע רכס עצביים upregulate גורם שעתוק SOX10 ויכולים להיות מבודד על ידי תא מופעל קרינת מיון עם נוגדני p75 ו HNK1.
תאי הרכס העצביים נגזרו להיות מלנוציטים לעבור שלב melanoblast ו upregulate KIT ו MITF (גורם שעתוק הקשורים microphthalmia) 6,21 MITF הוא רגולטור של פיתוח מלנוציט ומהווה גורם שעתוק אחראי לשליטה הרבה של פיתוח מלנוציט 22- 24. melanoblasts אדם נודד אל שכבת הבסיס של האפידרמיס שבו הם מתגוררים בין אם בליטת השיער או מוקף קרטינוציטים באפידרמיס (הקמת יחידות פיגמנטציה) לשמש מבשר אל מלנוציטים הבוגר, פיגמנט. הבידול וההתבגרות של melanoblasts לתוך מלנוציטים פיגמנט מתרחשים בד בבד עם קולוניזציה של נורת השיער וביטוי של מסלול ייצור המלנין (TYRP1, TYR, OCA2 וPMEL) 25,26.
בידוד מלנוציטים אדם melanoblasts מחולים הוא יקר, קשה להגביל בכמות. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים להבחין hPSCs (induced או עוברי) לתוך מלנוציטים או מבשרי מלנוציט בשיטה מוגדרת היטב, מהירה, לשחזור, מדרגים, וזולה ללא מיון תא. הפרוטוקול שמש בעבר לזהות פגמים ספציפיים למחלה כאשר הבחנת iPSCs מחול עם הפרעות פיגמנטציה.
עבור הבידול המוצלח של מלנוציטים מ hPSCs את ההצעות הבאות צריכות להילקח בחשבון. בראש ובראשונה, חשוב לעבוד בתנאי תרבות סטרילית בכל העת. בנוסף, חשוב להתחיל עם פלוריפוטנטיים, hPSCs מובחן לחלוטין; אם האוכלוסייה החלה מכילה תאים מובחנים התשואה תמיד תרד כגורם הזיהום לא יכול להיות ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענק לחוקרים מלנומה מקרן ג'ואנה מ ניקולאי ועל ידי המכון הלאומי לבריאות בארה"ב תחת רות ל Kirschstein הלאומית למחקר שירות הפרס F31. עבודה זו נתמכה על עוד דרך מענקי NYSTEM והיוזמה תא גזע Tri-המוסדית (סטאר הקרן).
Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
apo human transferrin | Sigma | T1147 | |
Ascorbic Acid (L-AA) | Sigma | A4034 | 100 mM |
B27 (B27 Supplement) | Invitrogen | 17504044 | |
β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 10 mg/ml |
BMP4 | R&D Systems | 314-bp | |
CHIR99021 | Tocris-R&D Systems | 4423 | 6 mM |
Cholera toxin | Sigma | C8052 | 50 mg/ml |
cAMP (cyclicAMP) | Sigma | D0627 | 100 mM |
Dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | 50 μM |
DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco-Life Technologies | 11985-092 | |
DMEM/F12 – Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Life Technologies | 1133–032 | |
DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
EDN3 (Endothelin-3, human) | American Peptide Company | 88-5-10B | 100 μM |
Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | 200 μg/ml |
gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | 0.1% in PBS | |
Glucose | Sigma | G7021 | |
Human insulin | Sigma | I2643 | |
ITS+ Universal Culture Supplement Premix | BD Biosciences | 354352 | |
KSR (Knockout Serum Replacement) | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | |
Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | 100 mM |
Low glucose DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | Dissolve 1:20 in DMEM/F12 |
MCDB201 Medium | Sigma | M6770 | |
MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-080 | |
Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-8105M | |
Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | 1 mg/ml |
Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
Penicilin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/ml |
Poly-L Omithin hydrobromide | Sigma | P3655 | 15 mg/ml |
Progesterone | Sigma | P8783 | 0.032g in 100ml 100% ethanol |
Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
FGF2 (Recombinant human FGF basic) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | 10 mg/ml |
SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1814 | 10 mM |
Selenite | Sigma | S5261 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
SCF (Stem Cell Factor, recombinant Human) | Peprotech Inc. | 300-07 | 50 μg/ml |
TYRP1 (G-17) Antibody | Santa Cruz | 10443 | 1:200 |
TYRP2 Antibody | Abcam | 74073 | 1:200 |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | 10 mM |