Summary

Analiz<em> İn Vivo</em> Hücre Göç Zebra balığı Embriyolar hücre nakli ve Time-lapse Görüntüleme kullanılarak

Published: April 29, 2016
doi:

Summary

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

Abstract

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Introduction

Çok hücreli organizmalarda, hücre göçü bu doku ve organların içine hücreleri organizasyonunu sağlayan embriyonun gelişimi için ve doku homeostazında (yara iyileşmesi) ve bağışıklık yer alır erişkin yaşamda, hem esastır. Bu fizyolojik fonksiyonlara ek olarak, hücre göçü, kanser metastazı, dahil olmak üzere, özellikle de çeşitli patolojik durumlarda, katılır.

Hücre göçü düz yüzeylere hücre hareketlerini sağlayan moleküler mekanizmaların genel bir anlayış sağlayarak, yıllardır in vitro analiz edilmiştir. Vivo Bununla birlikte, hücreler daha karmaşık bir çevre tarafından karşı karşıya kalırlar. Açık bir şekilde taşıma kılavuz hücreleri ya da salgılanan kemokinler, komşu gibi hücre dışı matris olarak bir organizma içindeki geçiş dış işaretlere etkilenebilir geçmiş yıllarda ortaya çıkan ve bu tarif edilmiştir ne değişebilir hücre göçü tahrik mekanizmaları <em> in vitro 1,2. Vivo hücre göçü temin eden mekanizmaların in vitro çalışmalar ile karşılaştırıldığında, esas olarak, çünkü artan teknik zorluk, şimdiye kadar daha az ilgi görmüştür. In vivo özellikle hücre göçü analizi göç hücrelere doğrudan optik erişim gerektiren, benzersiz hücreleri etiketlemek için teknikler kendi dinamiklerini ve morfolojisi yanı sıra kazanç veya fonksiyon kaybını görmek için aday genlerin rolü test etmek için yaklaşımlar. Şimdiye kadar, bu özellikleri barındıran bir kaç model sistemler vivo hücre göçü 3 incelemek için kullanılmıştır.

Biz son zamanlarda vivo hücre göçü 4,5 yılında kontrolünde aday genlerin fonksiyonunu değerlendirmek için yeni bir uygun model sistem olarak erken Zebra balığı embriyolarının prospektif prechordal plaka göç kullanılır. (Aynı zamanda, ön mesendoderm olarak da bilinir) Aday prechordal plakası Gast başlangıcında oluşturan hücrelerin bir grup olduğuEmbriyonun sırt tarafında rulation. Gastrulasyon sırasında bu grup topluca Notokordun için prechordal plaka, bir mesendodermal kalınlaşma, anterior oluşturur ve nöral plakayı altta yatan, embriyo 6-8 hayvan kutup doğru göç eder. Posterior kısmı muhtemelen mezoderm 9 kafa katkıda iken prechordal plaka ön kısmı, kuluçka bezinin yol açacaktır. dış gelişme ve balık embriyo optik berraklık sayesinde, hücre göçü, doğrudan ve kolay bir yapı görülür.

Hücre nakli mozaik embriyoların 10 hızlı ve kolay yaratılması için izin veren çok güçlü bir tekniktir. İzole hücrelerin etiketleme nakledilen hücrelerin sonuçlarında floresan sitoskeletal belirteçleri ifade, morfolojisi ve dinamikleri olan kolaylıkla görülebilir. kayıp veya fonksiyon kazancı bu birleştiren izinlerin bir kutu hücre özerk fonksiyonların analizi yaklaşımlarıdidate geni.

Sunulan protokol in vivo 5 hücre göçü ve aktin dinamiklerini kontrol TORC2 bileşeni sin1 işlevini değerlendirildi açıklamaktadır. Sonuçlar belirtilen ve daha fazla ele alındığı gibi Ancak, in vivo olarak, hücre göçü kontrol herhangi bir aday genin potansiyel implikasyonları analiz etmek için kullanılabilir.

Protocol

Not: Şekil 1 protokolünün anahat sunar. Enjeksiyon ve Transplantasyon için iğneler hazırlanması 1. Not: İğneler her zaman hazırlanmış ve saklanabilir. modelleme kil bandında, bir Petri kabındaki tutun. tozdan korumak için parafilm çanak mühür. Enjeksiyon iğneleri, bir mikropipet çektirmesi ile (Malzeme listesine bakınız) (filamanın (Malzeme listesine bakınız) olmadan, çap 0.58…

Representative Results

Sunulan teknik vivo hücre göçü kontrol, sin1, Tor karmaşık 2 (TORC2) çekirdek bileşenlerinden biri rolünü analiz etmek için kullanıldı. hücre nakli kullanımı izole hücreler ve hücre özerk etkilerinin analizi etiketleme izin verir. Film S1 nakledilen prechordal plaka progenitör hücrelerin göçünü gösteriyor. ABP140 ile Aktin etiketleme aktin zengin sitoplazmik uzantıların kolay görüntüleme sağlar. Biz onların sıklığını ve yönünü ö…

Discussion

Bu protokol, in vivo olarak, canlı görüntüleme hücre transplantasyonu ile kimerik embriyo oluşturulmasını birleştirerek hücre göçü bir aday genin rolünü araştırmak için kolay bir yol sunar.

mozaik embriyoların Yaratılış

Bir hücrenin dinamiklerini incelenmesi sitoplazmik uzantıları analiz etmek onun konturu görselleştirme gerektirir. böylece iyi bir görsel kontrast sunan, çevre – ya da farklı etiketli – Bu bir başka etikets…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank F. Bouallague and the IBENS animal facility for excellent zebrafish care. Research reported in this publication was supported by the Fondation ARC pour la recherche sur le cancer, grants N° SFI20111203770 and N° PJA 20131200143.

Materials

Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm) Harvard Apparatus 300085 standard thickness
Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm) Harvard Apparatus 300085 thin-walled
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333 10 000 units penicillin and 10 mg streptomycin per ml
fine tweezers Dumont Fine Science Tools 11254-20 5F
glass bottom dishes MatTek P35G-0-10-C
Air transjector Eppendorf 5246
Micro-forge Narishige MF-900
Microgrinder Narishige EG-44
Micromanipulator (for injection) Narishige MN-151
Micromanipulator (for cell transplantation) Leica Leica Micromanipulator
Hammilton Syringe Narishige IM-9B
Micropipette puller David Kopf Instruments Model 720
Transplantation mold Adapative Science Tools PT-1
Needle holder Narishige HI-7
Tube connector Narishige CI-1
PTFE tubing Narishige CT-1

Referências

  1. Charras, G., Sahai, E. Physical influences of the extracellular environment on cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 813-824 (2014).
  2. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: A multiscale tuning model. Journal of Cell Biology. 188 (1), 11-19 (2010).
  3. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature reviews. Molecular cell biology. 10 (7), 445-457 (2009).
  4. Dang, I., Gorelik, R., et al. Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration. Nature. , (2013).
  5. Dumortier, J. G., David, N. B. The TORC2 Component, Sin1, Controls Migration of Anterior Mesendoderm during Zebrafish Gastrulation. Plos One. 10, e0118474 (2015).
  6. Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish. BioEssays. 17 (11), 931-939 (1995).
  7. Ulrich, F., Concha, M. L., et al. Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation. Development. 130 (22), 5375-5384 (2003).
  8. Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 1-6 (2012).
  9. Gritsman, K., Talbot, W. S., Schier, A. F. Nodal signaling patterns the organizer. Development. 127 (5), 921-932 (2000).
  10. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of visualized experiments : JoVE. (29), (2009).
  11. Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
  12. Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
  13. Gorelik, R., Gautreau, A. Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration. Nature Protocols. 9 (8), 1931-1943 (2014).
  14. Sacan, A., Ferhatosmanoglu, H., Coskun, H. CellTrack: An open-source software for cell tracking and motility analysis. Bioinformatics. 24 (14), 1647-1649 (2008).
  15. Tahinci, E., Symes, K. Distinct functions of Rho and Rac are required for convergent extension during Xenopus gastrulation. Developmental biology. 259 (2), 318-335 (2003).
  16. Zhang, T., Yin, C., et al. Stat3-Efemp2a modulates the fibrillar matrix for cohesive movement of prechordal plate progenitors. Development. 141 (22), 4332-4342 (2014).
  17. Riedl, J., Crevenna, A. H., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  18. Burkel, B. M., Von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (11), 822-832 (2007).
  19. Yoo, S. K., Deng, Q., Cavnar, P. J., Wu, Y. I., Hahn, K. M., Huttenlocher, A. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Developmental cell. 18 (2), 226-236 (2010).
  20. Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental biology. 393 (2), 209-226 (2014).
  21. Johnson, H. W., Schell, M. J. Neuronal IP3 3-kinase is an F-actin-bundling protein: role in dendritic targeting and regulation of spine morphology. Molecular biology of the Cell. 20 (24), 5166-5180 (2009).
  22. Yi, J., Wu, X. S., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).

Play Video

Citar este artigo
Giger, F. A., Dumortier, J. G., David, N. B. Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (110), e53792, doi:10.3791/53792 (2016).

View Video