Quantificação de filamentosas actina (F-actina) puncta no Rat neurônios corticais
Summary
Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.
Abstract
proteína actina filamentosa (F-actina) desempenha um papel importante na spinogenesis, plasticidade sináptica, e estabilidade sináptica. Mudanças nas estruturas ricas F-actina dendríticas sugerem alterações na integridade sináptica e conectividade. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a cultura de rato primária neurônios corticais, coloração faloidina para puncta F-actina, e técnicas de quantificação subsequentes. Em primeiro lugar, o córtex frontal de embriões de rato E18 são dissociados em cultura celular de baixa densidade, em seguida, os neurónios cultivados in vitro durante pelo menos 12-14 dias. Após o tratamento experimental, os neurônios corticais estão manchadas com AlexaFluor 488 faloidina (para rotular o puncta F-actina dendrítica) e proteína associada a microtúbulos 2 (MAP2; para validar as células neuronais e integridade dendrítica). Finalmente, software especializado é usado para analisar e quantificar dendrites neuronais selecionados aleatoriamente. F-actina estruturas ricas são identificados na segunda ordem ramos dendríticas (variação de comprimento 25-75 &# 181; m) com imunofluorescência MAP2 contínua. O protocolo apresentado aqui vai ser um método útil para investigar mudanças nas estruturas sinapse dendríticas subsequentes aos tratamentos experimentais.
Introduction
O principal objetivo deste estudo é desenvolver um método fiável de medição (estimativa) de integridade sináptica da rede dendrítica neuronal. Aqui nós descrevemos quantificação de puncta F-actina em ratos primário neurônios cultivados usando uma combinação de coloração faloidina e detecção imunocitoquímica (ICC) de dendrites com posterior análise usando software especializado (NIS-Elements).
Falotoxina rotulados têm afinidade semelhante tanto para grandes e pequenos filamentos (F-actina), mas não se ligam a monomérica actina globular (G-actina), ao contrário de alguns anticorpos de actina 1. A ligação não específica de faloidina é insignificante, proporcionando assim fundo mínima durante imagiologia celular. Faloidina é muito menor do que os anticorpos que seria normalmente usado para marcar as proteínas celulares para a microscopia de fluorescência, o que permite muito mais intensa marcação da actina F por faloidina. Assim, imagens detalhadas de localização F-actina em neurônios pode serobtida através do uso de faloidina etiquetada.
Phalloidin (F-actina) coloração das dendrites neuronais gera discretos "pontos quentes" ou brilhante "puncta", que representam uma variedade de estruturas dendríticas, incluindo espinhas maduras, sinapses não-espinhosos 2 e espinhas imaturos. Espinhos imaturos incluem filopódios finas e algumas formas de morfologia remendo, e pode representar o início de spinogenesis 3. Espinhos imaturos e patches não-espinhosos falta PSD95 4. Mudanças na produção de chumbo F-actina para alterações subsequentes não só espinhos, mas também estruturas dendríticas adicionais, tornando assim faloidina uma ferramenta importante para a investigação de integridade synaptodendritic 5-7. Em geral, o número de (F-actina) puncta faloidina-positivos refletem um equilíbrio entre as sinapses ativas (excitatórios e inibitórios), dinâmica de actina e estabilidade sinapse 8.
Embora seja importante para o estudo específico tYpes de sinapses (isto é, espinhas excitatórios), quando o alvo de um tratamento é desconhecido, é necessário primeiro estimar a integridade geral de uma variedade de estruturas dendríticas. Uma vez que a actina F é um componente importante das espinhas dendriticas e outras estruturas, incluindo sinapses inibitórias, um número alterado de pontos lacrimais F-actina pode indicar um synaptopathy. Este synaptopathy pode então ser mais investigada para alterações mais específicos. O nosso método de quantificação para a detecção de vários tipos / sinápticas estruturas produz uma estimativa global das alterações sinápticas dendríticas (aumentos e diminuições) após vários tratamentos experimentais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, descrevemos a cultura de neurônios corticais de rato em baixa densidade em pratos com fundo de vidro de 35 mm, o que nos permite identificar dendritos de neurônios individuais. Em seguida, usamos faloidina e coloração MAP2 para detectar alterações dendríticas. Em seguida, foi utilizado um software especializado para quantificar mudanças na puncta F-actina.
Para determinar mudanças na puncta F-actina toda a rede neuronal de um neurônio individual deve ser claramente…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by NIH grants DA013137, DA031604, and HD043680. Partial support was provided by a NIH T32 training grant in Biomedical-Behavioral science.
Materials
| 35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| ProLong Gold | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| AlexaFluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Normal horse serum | Life Technologies | 26050-070 | |
| Chicken polyclonal anti-MAP2 | abcam | Ab92434 | |
| Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG | Life Technologies | A11042 | |
| NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 | Life Technologies | R37605 | |
| NIS-Elements software package | Nikon Instruments | ||
| Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope | Nikon Instruments | ||
| 0.2 μm Nalgene nylon membrane filter | Fishersci | 151-4020 |
Referências
- Heller, E. A., et al. The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses. PLoS One. 7, e39572 (2012).
- Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. Selective clustering of glutamate and gamma-aminobutyric acid receptors opposite terminals releasing the corresponding neurotransmitters. Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12373-12377 (1994).
- Johnson, O. L., Ouimet, C. C. A regulatory role for actin in dendritic spine proliferation. Brain Res. 1113, 1-9 (2006).
- Rao, A., Craig, A. M. Signaling between the actin cytoskeleton and the postsynaptic density of dendritic spines. Hippocampus. 10 (5), 527-541 (2000).
- Matus, A., Ackermann, M., Pehling, G., Byers, H. R., Fujiwara, K. High actin concentrations in brain dendritic spines and postsynaptic densities. Proc Natl Acad Sci USA. 79, 7590-7594 (1982).
- Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors. J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).
- Sekino, Y., Kojima, N., Shirao, T. Role of actin cytoskeleton in dendritic spine morphogenesis. Neurochem Int. 51, 92-104 (2007).
- Zhang, W., Benson, D. L. Stages of synapse development defined by dependence on F-actin. J Neurosci. 21 (14), 5169-5181 (2001).
- Bertrand, S. J., Aksenova, M. V., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 Tat protein variants: Critical role for the cysteine region in synaptodendritic injury. Exp Neurol. 248, 228-235 (2013).
- Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Aksenova, M. V., Espensen-Sturges, T. D., Booze, R. M. Synaptodendritic recovery following HIV Tat exposure: neurorestoration by phytoestrogens. J Neurochem. 128 (1), 140-151 (2014).
- Lau, P. M., Zucker, R. S., Bentley, D. Induction of filopodia by direct local elevation of intracellular calcium ion concentration. J Cell Biol. 145, 1265-1275 (1999).
