Kvantifiering av fintrådiga aktin (F-aktin) puncta i Rat kortikala Neuroner
Summary
Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.
Abstract
Filamentöst aktin protein (F-aktin) spelar en viktig roll i spinogenesis, synaptisk plasticitet, och synaptic stabilitet. Förändringar i dendritiska F-aktin rika strukturer föreslår förändringar i synaptiska integritet och anslutningsmöjligheter. Här ger vi ett detaljerat protokoll för odling primära råtta kortikala neuroner, Phalloidin färgning för F-aktin puncta, och efterföljande kvantifiering tekniker. Först den frontala cortex av E18 råttembryon dissocierade i låg densitet cellkultur, då nervceller som odlas in vitro under minst 12-14 dagar. Efter experimentell behandling, de kortikala nervceller färgas med Alexafluor 488 Phalloidin (för att märka den dendritiska F-aktin puncta) och mikrotubuli-associerat protein 2 (MAP2, att validera nervceller och dendritiska integritet). Slutligen är specialiserad programvara som används för att analysera och kvantifiera slumpmässigt utvalda neuronala dendriter. F-aktin rika strukturer identifieras på andra ordningens dendritiska grenar (längd intervall 25-75 &# 181; m) med kontinuerlig MAP2 immunofluorescens. Protokollet presenteras här kommer att bli en användbar metod för att undersöka förändringar i dendritiska synaps strukturer efterföljande experimentella behandlingar.
Introduction
Det primära målet med studien är att utveckla en tillförlitlig metod för mätning (uppskattning) av synaptisk integritet neuronala dendritiska nätverket. Här beskriver vi kvantifiering av F-aktin puncta i primär råtta odlade nervceller med hjälp av en kombination av Phalloidin färgning och immuncytokemiska (ICC) detektering av dendriter med efterföljande analys med hjälp av specialiserade (NIS-Elements) programvara.
Märkta phallotoxins har liknande affinitet för både stora och små trådar (F-aktin) men inte binder till monoklot aktin (G-aktin), till skillnad från vissa aktin antikroppar 1. Ospecifik bindning av Phalloidin är försumbar, vilket ger minimal bakgrunden under cellulär avbildning. Falloidin är mycket mindre än antikroppar som typiskt skulle kunna användas för att märka cellulära proteiner för fluorescensmikroskopi, vilket möjliggör en mycket mer intensiv märkning av F-aktin med falloidin. Således kan detaljerade bilder av F-aktin lokalisering i nervceller varaerhålls genom användning av märkt Phalloidin.
Phalloidin (F-aktin) färgning av neuronala dendriter genererar diskreta "hot spots" eller ljus "puncta", som utgör en mängd av dendritiska strukturer, inklusive mogna ryggar, icke-taggiga synapser 2 och omogna ryggar. Omogna ryggar inkluderar tunna filopodia och vissa former av plåster morfologi, och kan representera initieringen av spinogenesis 3. Omogna ryggar och icke-taggiga plåster saknar PSD95 4. Förändringar i produktionen av F-aktin leder till senare ändringar i inte bara ryggar utan också ytterligare dendritiska strukturer, vilket gör Phalloidin ett viktigt verktyg för att utreda synaptodendritic integritet 5-7. I allmänhet, antal Phalloidin-positiva (F-aktin) puncta återspeglar en balans mellan aktiva synapser (retande och hämmande), aktin dynamik och synaps stabilitet 8.
Även om det är viktigt att studera specifika types av synapser (dvs excitatoriska ryggar), när målet för en behandling är okänd är det nödvändigt att först beräkna den allmänna integriteten hos en variation av dendritiska strukturer. Eftersom F-aktin är en viktig del av Dendritutskotten och andra strukturer, inklusive hämmande synapser, en förändrad antal F-aktin puncta kan tyda på en synaptopathy. Denna synaptopathy kan sedan undersökas vidare för mer specifika förändringar. Vår kvantifiering metod för att detektera flera synaptiska typer / konstruktioner ger en övergripande uppskattning av dendritiska synaptiska förändringar (ökningar och minskningar) efter olika experimentella behandlingar.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta protokoll, beskriver vi odling råtta kortikala neuroner vid låg densitet i 35 mm glasbottnade rätter som gör det möjligt för oss att identifiera dendriter av enskilda nervceller. Nästa använder vi Phalloidin och MAP2 färgning att upptäcka dendritiska förändringar. Sedan använde vi specialiserad programvara för att kvantifiera förändringar i F-aktin puncta.
För att bestämma förändringar i F-aktin puncta hela neuronala nätverket av en enskild neuron måste vara tyd…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by NIH grants DA013137, DA031604, and HD043680. Partial support was provided by a NIH T32 training grant in Biomedical-Behavioral science.
Materials
| 35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| ProLong Gold | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| AlexaFluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Normal horse serum | Life Technologies | 26050-070 | |
| Chicken polyclonal anti-MAP2 | abcam | Ab92434 | |
| Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG | Life Technologies | A11042 | |
| NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 | Life Technologies | R37605 | |
| NIS-Elements software package | Nikon Instruments | ||
| Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope | Nikon Instruments | ||
| 0.2 μm Nalgene nylon membrane filter | Fishersci | 151-4020 |
Referências
- Heller, E. A., et al. The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses. PLoS One. 7, e39572 (2012).
- Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. Selective clustering of glutamate and gamma-aminobutyric acid receptors opposite terminals releasing the corresponding neurotransmitters. Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12373-12377 (1994).
- Johnson, O. L., Ouimet, C. C. A regulatory role for actin in dendritic spine proliferation. Brain Res. 1113, 1-9 (2006).
- Rao, A., Craig, A. M. Signaling between the actin cytoskeleton and the postsynaptic density of dendritic spines. Hippocampus. 10 (5), 527-541 (2000).
- Matus, A., Ackermann, M., Pehling, G., Byers, H. R., Fujiwara, K. High actin concentrations in brain dendritic spines and postsynaptic densities. Proc Natl Acad Sci USA. 79, 7590-7594 (1982).
- Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors. J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).
- Sekino, Y., Kojima, N., Shirao, T. Role of actin cytoskeleton in dendritic spine morphogenesis. Neurochem Int. 51, 92-104 (2007).
- Zhang, W., Benson, D. L. Stages of synapse development defined by dependence on F-actin. J Neurosci. 21 (14), 5169-5181 (2001).
- Bertrand, S. J., Aksenova, M. V., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 Tat protein variants: Critical role for the cysteine region in synaptodendritic injury. Exp Neurol. 248, 228-235 (2013).
- Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Aksenova, M. V., Espensen-Sturges, T. D., Booze, R. M. Synaptodendritic recovery following HIV Tat exposure: neurorestoration by phytoestrogens. J Neurochem. 128 (1), 140-151 (2014).
- Lau, P. M., Zucker, R. S., Bentley, D. Induction of filopodia by direct local elevation of intracellular calcium ion concentration. J Cell Biol. 145, 1265-1275 (1999).
