Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated.
Overvåking arthropod bevegelse er ofte nødvendig for å bedre forstå forbundet populasjonsdynamikk, spredningsmønster, vertsplanten preferanser, og andre økologiske interaksjoner. Leddyr er vanligvis spores i naturen ved å merke dem med en unik mark og deretter samle dem over tid og rom til å bestemme deres spredningstakt. I tillegg til faktiske fysiske koder, slik som farget støv eller maling, ulike typer proteiner vist seg svært effektivt for merking leddyr for økologisk forskning. Proteiner kan administreres internt og / eller eksternt. Proteinene kan deretter bli detektert på inndekning av artropoder med et protein-spesifikke enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA). Her beskriver vi protokoller for eksternt og internt tagging leddyr med protein. To enkle eksperimentelle eksempler er vist: (1) en innvendig protein merket introdusert til et insekt ved å tilveiebringe et protein-anriket diett og (2) en ytre protein mark en topiskpplied til et insekt ved hjelp av en medisinsk forstøver. Vi forholder en steg-for-steg guide av sandwich og indirekte ELISA metoder som brukes til å påvise protein merker på insekter. I denne demonstrasjonen, er ulike aspekter av oppkjøpet og påvisning av protein markører på leddyr for mark-release-gjenfangst, mark-fangst, og selv-mark-fangst typer forskning diskutert, sammen med de ulike måter som immunomarking prosedyren har vært tilpasses et bredt spekter av forskningsmålene.
Sporing bevegelsen av leddyr skadedyr, naturlige fiender (parasitter og predatorer) og pollinatorer i naturen er viktig for bedre forståelse hvordan du kan forbedre økosystemtjenester. Nøkkelen komponent for de fleste typer spredning forskning er å ha en pålitelig metode for å tagge leddyr (r) av interesse. En rekke materialer (f.eks, maling, fargestoffer, farget støv, tags, sjeldne elementer, proteiner) har blitt brukt til å markere leddyr for å vurdere deres populasjonsdynamikk, spredningstakt, fôring atferd, og andre økologiske interaksjoner 1,2.
Hensiktsmessigheten av en markør som brukes for en gitt sprednings forskning vil være avhengig av type studie blir utført. Det er tre store kategoriseringer for merking leddyr: (1) mark-release-gjenfangst (MRR), (2) mark-fangst, og (3) selv mark-fangst. For mark-release-gjenfangst forskning, undersøkeren vanligvis markerer leddyr kollektivt i laboratoriumry og frigjør dem på et sentralt punkt i feltet. Leddyr deretter gjenerobret på ulike romlige og tidsmessige intervaller ved hjelp av ulike innsamlings enheter (f.eks feie netto, vakuum, klebrig felle) 3,4,5. De gjenerobret prøvene blir deretter undersøkt for den spesifikke mark for å skille løslatt fra innfødte individer. For mark-fangst forskning, gjelder etterforsker vanligvis merket direkte i feltet med sprøyteutstyr (f.eks ryggsekk sprøyta, bom og dysen sprøyter). De beste markører for mark-fangst forskning er billig og lett brukes på leddyr habitat. For selv mark-fangst forskning, gjelder etterforsker vanligvis merker til en leddyr agn 6,7 eller reir inngang 8. I sin tur, arthropod markerer seg internt av fortærende merket agn eller eksternt ved "pusse" opp mot mark som det kommer ut av redet.
Som nevnt ovenfor, har mange typer av markører vært ossed å merke en rekke leddyr arter. Men svært få er nyttig for alle disse tre spredningsforsknings kategorier. Utviklingen av proteinet immunomarking prosedyren var et stort gjennombrudd for merking insekter. Immunomarking setter et protein merket med leddyr, enten internt eller eksternt, som, i sin tur, blir detektert ved hjelp av en anti-protein bestemt enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA). Den første slike proteinmarkører som ble brukt var kanin-immunoglobulin (IgG) og kylling IgG / IgY 9,10. De viste seg å være svært effektive karakterer for MRR og selv mark-fangst forskning (se omtale). Dessverre, IgG / IGY proteiner er kostbart og er derfor ikke praktisk for mark-fangst forskning og de fleste typer selv mark-fangst forskning. Deretter ble andre generasjon protein deteksjon ELISAer utviklet for proteiner som finnes i kylling eggehviter (albumin), kumelk (kasein) og soyamelk (trypsin inhibitor protein). Hver analyse er svært sensitive, spesifikke og de flesteviktigere, benytter proteiner som er mye rimeligere enn IgG / IgY proteiner 11. Disse proteinene har vist seg effektive for MRR, mark-fangst, og selv-mark-fangst forskning (se omtale).
I denne artikkelen vil vi beskrive og demonstrere hvordan gjennomføre protein mark laboratorium oppbevaring studier. Slike studier er den første fasen av forskning er nødvendig for alle typer felt spredning studien. Spesielt er det viktig at etterforskerne vet hvor lenge mark vil bli beholdt på målrettede leddyr arter før du tar fatt på feltet spredningsstudier. Her beskriver vi og demonstrere hvordan man internt og eksternt markere insekter for MRR, mark-fangst og selv-mark-fangst typen feltstudier. Vi viser hvordan du kan oppdage tilstedeværelsen av merkene med indirekte og sandwich ELISA.
Den arthropod protein immunomarking prosedyren ble først beskrevet nesten et kvart århundre siden 9. Siden den gang har prosedyren blitt tilpasset til å studere spredningsmønstre et bredt utvalg av leddyr som bruker både internt og eksternt administreres IgG / IgYs. Disse proteinene har vist seg urokkelige markører for det brede spekter av insektarter som ble testet hittil. Imidlertid, som nevnt ovenfor, er den viktigste begrensning for bruk av IgG / IgYs at de er svært kostbart. Følgelig IgG / IgYs e…
The authors have nothing to disclose.
Finansieringen ble levert av USDA CRIS 5347-22620-021-00D og dels ved Landbruks- og matdepartementet Forskningsinitiativet Competitive Grant no. 2011-67009-30141 fra USDA National Institute of Food and Agriculture. Vi er takknemlige for den tekniske støtten fra Johanna Nassif. Vi takker også Paul Baker, David Horton, Diego Nieto, og Frances Sivakoff for å gi noen av bildene som brukes i Figur 3.
Food storage container (for insect rearing) | Rubbermaid/Tupperware | Various sizes | Various manufacturers & vendors. Mesh fabric is glued in a window ` |
Small volume nebulizer (Micro Mist) | Teleflex-Hudson RCI | 1881 | Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well. |
Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap | Continental Lab Products | 4445.X | Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids. |
Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5×20 grid) | RPI Corp. | 145746 | This design is nice because it doesn't crowd the tubes. |
Dispenser, repeater | Eppendorf | 4982000322 | Anything similar will help speed up the dispensing. |
Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 mL | Kimble Chase | 749521-1500 | Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse. |
BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom) | BD | 351172 | |
Ovation pipette, manual (20-200 µl) | VistaLab | 1057-0200 or 1070-0200 | Any similar type will work. This model is ergonomic. |
Reservoirs, sterile reagent | VistaLab | 4054-1000 | Anything similar will work. |
Electronic pipette, 8-channel (50-1200 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730391 | If you had to pick one electronic model, this size is most useful. |
Electronic pipette, 8-channel (10-300 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730361 | Anything similar will work. |
Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight) | Sigma-Aldrich | Z369802 | Anything similar will work for manual plate washing. |
Microplate reader with absorbance detection | Molecular Devices | SpectraMax 250 | Anything similar will work. |
Chicken IgG/IgY | United States Biological | I1903-15R | Also available from other sources |
Egg whites | Grocery store | “All Whites”, “Egg Beaters”, etc. | Mix 5 mL with 95 mL dH2O for 5% solution |
Tris (Trizma Base) | Sigma-Aldrich | T1503 | 2.42 g/L to make TBS |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | 29.22 g/L to make TBS and 8.0 g/L for PBS |
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S0876 | 1.14 g/L for PBS |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | 0.2 g/L for PBS |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | 0.2 g/L for PBS |
Tween 20, EIA grade | Sigma-Aldrich | P1379 | Add 0.5 mL per L to PBS after salts are dissolved. |
PBS with 1% BSA | Sigma-Aldrich | P3688 | Mix 1 packet in 1 L dH20 |
Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500) | Sigma-Aldrich | C6409 | Mix 100 µl in 50 ml TBS |
Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%) | Grocery store | Mix 10 g with 1 L dH2O for 1% solution | |
Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10000) | Sigma-Aldrich | A9046 | Mix 100 ul in 1 L of 1% milk |
Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8000) | Sigma-Aldrich | C6534 | Dilute 125 µl in 1 L PBS-BSA |
Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2000) | Sigma-Aldrich | A6154 | Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3 ml Silwet |
Vac-In-Stuff (Silwet L-77)silicon-polyether copolymer | Lehle Seeds | VIS-01 | Add as last ingredient |
TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate | SurModics | TMBW-1000-01 |