Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated.
節足動物の動きを監視することは、多くの場合、よりよい関連する人口動態、分散パターン、宿主植物の環境、およびその他の生態系の相互作用を理解するために必要です。節足動物は、通常、分散能力を決定するために、時間と空間の上にそれらをユニークなマークでそれらをタグ付けし、その後再収集することにより、自然の中で追跡されます。そのような着色埃や塗料などの実際の物理的なタグに加えて、タンパク質の様々なタイプの生態研究の節足動物をマーキングするための非常に効果的であることが証明されています。タンパク質は、内部および/または外部から投与することができます。タンパク質は、その後、タンパク質に特異的な酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって奪還節足動物に検出することができます。ここでは、外部と内部のタンパク質と節足動物をタグ付けするためのプロトコルについて説明します。 2つの単純な実験例が示されています。タンパク質が豊富な食事を提供することで、昆虫に導入(1)内部のタンパク質マークと(2)外部のタンパク質マーク局所医療ネブライザーを用いて、昆虫にpplied。それから、サンドイッチや昆虫タンパク質にマークを検出するために使用される間接的なELISA法を順を追って説明を関連付けます。このデモでは、マーク・リリース・再捕獲、マーク・キャプチャ、および研究の自己マークキャプチャー・タイプの節足動物の取得及びタンパク質マーカーの検出の様々な側面は、免疫標識手順がされているさまざまな方法と一緒に、議論されています研究目的の多種多様に合うように適合されます。
節足動物害虫、天敵(寄生蜂と捕食者)、そして自然の中で花粉媒介の動きを追跡することは、生態系サービスを改善するための方法をより良く理解するために不可欠です。分散研究のほとんどのタイプのための重要な構成要素は、関心の節足動物(複数可)をタグ付けするための信頼できる方法を有しています。様々な材料(例えば、塗料、染料、着色粉剤、タグ、希少元素、タンパク質)は、それらの個体群動態、分散能力、摂食行動、及び他の生態系の相互作用を評価するために、1,2-節足動物をマークするために使用されています。
任意の分散研究のために使用されるマーカーの妥当性は、行われている研究の種類に依存することになります。 (1)マーク・リリース・再捕獲(MRR)、(2)マーク・キャプチャー、および(3)自己マークキャプチャ:節足動物をマーキングするための3つの広範な分類があります。マーク・リリース・再捕獲調査のために、研究者は一般的にlaboratoに一括して節足動物をマークRYとフィールドの中心点でそれらを解放します。節足動物は、異なる収集装置(例えば、掃引ネット、真空、粘着トラップ)3,4,5を用いて様々な空間的および時間的間隔で再捕獲されています。奪還の標本は、その後ネイティブ個人から解放区別するために、特定のマークを調べます。マーク捕獲調査のために、研究者は通常、噴霧装置(例えば、バックパック噴霧器、ブーム及びノズル噴霧器)を使用して、フィールドに直接マークを適用します。マーク・キャプチャ研究のための最善のマーカーは、安価であり、容易に節足動物の生息地に適用されます。自己マーク捕獲調査のために、研究者は通常、節足動物の餌6,7または巣の入り口8にマークを適用します。ターンでは、節足動物は、巣を出るときにマークアップに対する「ブラッシング」でマークされた餌または外部をむさぼり食うことにより、内部で自身をマーク。
前述したように、マーカーの多くの種類は、私たちがしていますedは節足動物の種の多様性をタグ付けします。しかし、非常に少数のは、これらの分散の研究カテゴリーのすべての3のために有用です。タンパク質の免疫標識法の開発は、昆虫をマークするための主要なブレークスルーでした。免疫標識は、内部または外部節足動物にタンパク質標識を置くれ、次に、抗タンパク質特異的酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって検出されます。使用された最初のようなタンパク質マーカーは、ウサギ免疫グロブリン(IgGの)およびニワトリのIgG / IgYの9,10ました。彼らは(説明を参照してください)MRRと自己マークキャプチャー・研究のための非常に有効なマークであることが判明しました。残念ながら、IgGの/ IgYのタンパク質は高価であり、したがって、マーク・キャプチャ・研究と自己マーク捕獲調査のほとんどのタイプのための実用的ではありません。続いて、第2世代のタンパク質検出ELISAは鶏卵の白身(アルブミン)、牛乳(カゼイン)と豆乳(トリプシンインヒビタータンパク質)に含まれるタンパク質のために開発されました。各アッセイは、特異的、高感度であり、そして、最も重要なのは、はるかに安価のIgG / IgYのタンパク質11よりもタンパク質を使用しています。これらのタンパク質は、(議論を参照)MRR、マーク・キャプチャ、および自己マークキャプチャー・研究のための有効であることが判明しました。
この記事では、説明し、タンパク質マーク実験室での保持試験を実施する方法を示します。このような研究は、フィールド分散試験の任意のタイプのために必要な研究の第一段階です。具体的には、研究者はマークが前のフィールド分散の研究に着手をターゲットと節足動物の種に保持される時間の長さを知っていることが重要です。ここでは、説明し、内部と外部のMRRのための昆虫、マーク・キャプチャ、および自己マークキャプチャ型のフィールドスタディをマークする方法を示します。それから、間接的なサンドイッチELISA法でマークの存在を検出する方法を示します。
節足動物タンパク質の免疫標識手順は、最初の世紀前9のほぼ4分の1を説明しました。それ以来、手順が内部と外部の両方投与のIgG / IgYsを使用して、節足動物の多様な分散パターンを研究するために適応されています。これらのタンパク質は、これまでテストした昆虫種の多種多様な不動のマーカーを証明されています。しかしながら、上述したように、IgGの/ IgYsを使用するための主?…
The authors have nothing to disclose.
資金は、農業・食品産業技術総合研究イニシアティブ競争グラントノーにより、部分的には、米国農務省CRIS 5347-22620-021-00Dによって提供されました。食糧農業のUSDA国立研究所から2011-67009-30141。私たちは、ジョアンナナシフの技術サポートのために感謝しています。また、 図3で使用される写真のいくつかを提供するためのポール・ベイカー、デビッド・ホートン、ディエゴ・ニエト、とフランシスSivakoffに感謝します。
Food storage container (for insect rearing) | Rubbermaid/Tupperware | Various sizes | Various manufacturers & vendors. Mesh fabric is glued in a window ` |
Small volume nebulizer (Micro Mist) | Teleflex-Hudson RCI | 1881 | Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well. |
Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap | Continental Lab Products | 4445.X | Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids. |
Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5×20 grid) | RPI Corp. | 145746 | This design is nice because it doesn't crowd the tubes. |
Dispenser, repeater | Eppendorf | 4982000322 | Anything similar will help speed up the dispensing. |
Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 mL | Kimble Chase | 749521-1500 | Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse. |
BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom) | BD | 351172 | |
Ovation pipette, manual (20-200 µl) | VistaLab | 1057-0200 or 1070-0200 | Any similar type will work. This model is ergonomic. |
Reservoirs, sterile reagent | VistaLab | 4054-1000 | Anything similar will work. |
Electronic pipette, 8-channel (50-1200 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730391 | If you had to pick one electronic model, this size is most useful. |
Electronic pipette, 8-channel (10-300 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730361 | Anything similar will work. |
Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight) | Sigma-Aldrich | Z369802 | Anything similar will work for manual plate washing. |
Microplate reader with absorbance detection | Molecular Devices | SpectraMax 250 | Anything similar will work. |
Chicken IgG/IgY | United States Biological | I1903-15R | Also available from other sources |
Egg whites | Grocery store | “All Whites”, “Egg Beaters”, etc. | Mix 5 mL with 95 mL dH2O for 5% solution |
Tris (Trizma Base) | Sigma-Aldrich | T1503 | 2.42 g/L to make TBS |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | 29.22 g/L to make TBS and 8.0 g/L for PBS |
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S0876 | 1.14 g/L for PBS |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | 0.2 g/L for PBS |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | 0.2 g/L for PBS |
Tween 20, EIA grade | Sigma-Aldrich | P1379 | Add 0.5 mL per L to PBS after salts are dissolved. |
PBS with 1% BSA | Sigma-Aldrich | P3688 | Mix 1 packet in 1 L dH20 |
Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500) | Sigma-Aldrich | C6409 | Mix 100 µl in 50 ml TBS |
Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%) | Grocery store | Mix 10 g with 1 L dH2O for 1% solution | |
Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10000) | Sigma-Aldrich | A9046 | Mix 100 ul in 1 L of 1% milk |
Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8000) | Sigma-Aldrich | C6534 | Dilute 125 µl in 1 L PBS-BSA |
Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2000) | Sigma-Aldrich | A6154 | Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3 ml Silwet |
Vac-In-Stuff (Silwet L-77)silicon-polyether copolymer | Lehle Seeds | VIS-01 | Add as last ingredient |
TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate | SurModics | TMBW-1000-01 |