Analyse quantitative de l'expression des protéines pour l'étude de Lineage Spécification dans Souris préimplantatoire d'embryons

L'embryon préimplantatoire de souris est un modèle pour étudier l'émergence et le maintien de la pluripotence in vivo, ainsi que d'un modèle pour l'étude de la spécification du destin cellulaire et de novo épithélialisation chez les mammifères. Les étapes de pré-implantation du développement des mammifères sont dédiés à la mise en place des trois lignées cellulaires qui composent le blastocyste, à savoir l'épiblaste pluripotentes – qui donne lieu à la plupart des tissus somatiques et les cellules germinales – et deux lignées extra-embryonnaires, le trophectoderme (TE) et endoderme primitif (PRE) (figure 1A) ^1,2. Ce protocole décrit les procédures à (1) des embryons de souris récolte et fixer stade préimplantatoire, (2) effectuer immunofluorescence pour marquer des protéines d'intérêt, (3) d'effectuer l'ensemble du montage imagerie utilisant un microscope confocal avec des capacités et des z-sectionnement (4) effectuer la segmentation nucléaire d'images confocale et analyse d'image quantitative ultérieure. Ce pipeline permet til impartiales mesure des niveaux de protéines pour l'attribution des identités de cellules de caractériser les sous-populations de cellules in situ. Ce protocole peut être effectuée en moins de 3 à 4 jours pour un même portée (généralement jusqu'à 10 embryons de souris), de la collecte d'embryons à l'analyse de données (figure 1B). L'analyse simultanée de plusieurs portées augmenterait l'imagerie et l'analyse des données charge de temps, prolongeant ainsi la longueur totale du protocole.

L'embryon de souris au stade préimplantatoire est un système expérimental traitable qui, compte tenu de sa petite taille et la morphologie stéréotypée ^3, est bien adapté pour l'imagerie de toto de processus cellulaires avec une résolution seule cellule. Pour mener à bien un impartiale, l'analyse au niveau des systèmes d'un nombre statistiquement pertinent d'embryons, un système automatisé, d'un pipeline d'analyse quantitative est souhaitable. Cependant, en raison de la densité élevée nucléaire de la masse cellulaire interne (ICM) du blastocyste ( <strong> Figure 1A, 2D), les plates-formes de segmentation d'image conventionnels ne parviennent pas à fournir une précision suffisante pour établir un workflow automatisé ou semi-automatisé. D'autre part, la segmentation manuelle, bien que corrects, ne permet pas le traitement de grandes cohortes de cellules et d'embryons, ni approprié pour une détermination objective et reproductible des identités de cellules – ce qui est particulièrement important lorsque l'on étudie les stades de développement, où les modes de marqueur expression n'a pas entièrement résolue (par exemple, ne présentent pas une distribution binaire sur une population). Nous avons récemment développé et validé une méthode de segmentation d'image adaptée aux embryons au stade de pré-implantation de la souris et des cellules de souris embryonnaires souches (CES) qui atteint une grande précision, tout en exigeant utilisateur minimale entrée ^4-8.

Le pipeline d'analyse présentée ici tourne autour de l'outil de segmentation d'image basé sur MATLAB modulaire Interactive segmentation nucléaire (MIN) ^4. MN performs segmentation nucléaire sans surveillance sur des lots importants de Z-piles confocale après que l'utilisateur a établi un nombre minimal de propriétés de l'image, en utilisant une interface utilisateur graphique (GUI) (tableau 1) ^4. Ce pipeline est avéré efficace pour la génération de données à haut débit sur ​​l'expression des protéines et la localisation cellulaire à la fois de type sauvage, expérimentalement traitée et les embryons et les CES ^5-7 génétiquement modifié. Dans le présent protocole, nous décrivons l'application de minutes pour la segmentation d'images d'embryon préimplantatoire stade. Pour des exemples de performances mn à CES s'il vous plaît se référer ^{à 4,7.} L'étape automatisée de segmentation nucléaire permet de réduire considérablement la charge de temps du processus d'identification de cellule, alors que les mesures spatiales et intensité de fluorescence permettent une détermination objective des identités de cellules et la production de cartes en trois dimensions de domaines d'expression génique et la position des cellules dans l'embryon (figure 1C </strong>). Par ailleurs, l'évolutivité de ce flux de travail, il est applicable à l'analyse des portées individuelles à travers de grandes cohortes d'embryons expérimentalement traitées, ou des embryons de différentes origines génétiques ^5,6. MN est disponible gratuitement au http://katlab-tools.org (le logiciel nécessite une licence MATLAB).

Aucune approche développée à ce jour permet la génération de ces données en profondeur sur l'expression des protéines et la localisation cellulaire dans des embryons de pré-implantation de la souris. Toutes les tentatives jusqu'à présent à quantifier ces types de données ont été limitées à la détermination manuelle et la quantification du nombre de cellules pour différentes populations dans l'embryon (soit entièrement manuellement, ou un logiciel assistée) ^9-19. Cette approche (intégrant le logiciel MN) a été adapté et testé sur les embryons et les CES préimplantatoires souris; néanmoins ses performances sur d'autres systèmes à forte densité nucléaire, mais encore non testé, devrait être équivalent.