Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance.
الجينوم تحرير الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) يوفر منصة التحكم وراثيا وذات الصلة سريريا من خلاله فهم التنمية البشرية وتحقيق في الفيزيولوجيا المرضية للمرض. من خلال توظيف nucleases في مواقع محددة (أرقام الضمان الاجتماعي) لتحرير الجينوم، والاشتقاق السريع للخطوط hPSC جديدة إيواء تغيرات جينية محددة في بيئة إسوي خلاف ذلك يصبح ممكنا. إصبع الزنك nucleases (ZFNs)، النسخ الشبيهة المنشط nucleases المستجيب (TALENs) وتتجمع interspaced بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر) / Cas9 هي أرقام الضمان الاجتماعي الأكثر استخداما. كل هذه nucleases تعمل عن طريق إدخال كسر DNA مزدوج الجديلة في موقع محدد، وبالتالي تعزيز تحرير الجين الدقيق في مكان الجيني. SSN التأمل تحرير الجينوم يستغل اثنين من آليات الخلية الذاتية إصلاح الحمض النووي، ونهاية غير المتجانسة الانضمام (NHEJ) وتناظر إصلاح موجهة (HDR)، إما لتقديم الإدراج / طفرات الحذف أو بديلإيه الجينوم باستخدام قالب إصلاح مثلي في موقع كسر مزدوج الجديلة. Electroporation للمن hPSCs هو وسيلة فعالة لtransfecting أرقام الضمان الاجتماعي والقوالب إصلاح التي تضم الجينات المحورة مثل صحفيين الفلورسنت وأشرطة المقاومة للمضادات الحيوية. بعد Electroporation لل، فمن الممكن لعزل فقط تلك hPSCs التي أدرجت بناء إصلاح عن طريق اختيار لمقاومة المضادات الحيوية. فصل ميكانيكيا المستعمرات hPSC ويؤكد التكامل السليم في الموقع المستهدف من خلال التنميط الجيني يسمح لعزل خطوط الخلايا المستهدفة بشكل صحيح ومتجانسة وراثيا. ويتضح من صحة هذا البروتوكول هنا باستخدام كل المنابر SSN ثلاثة لدمج EGFP والمقاومة بوروميسين بناء في AAVS1 آمن مكان الميناء في الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان.
وتكنولوجيات تحرير الجينوم يتطور بسرعة إلى الأدوات القياسية لالجزيئي والخلوي علم الأحياء 1. الهندسة الوراثية للخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) هي ذات أهمية خاصة باعتبارها تمثل hPSCs مصدر تجديد الذات من خلايا الإنسان الأساسية سليمة وراثيا. يمكن أن تكون متباينة hPSCs إلى أنواع الخلايا المختلفة لنمذجة مرض أو كمصدر لعلاجات زرع 2،3. تظاهر هنا هو بروتوكول التي تستخدم ثلاثة أنواع مختلفة من nucleases في مواقع محددة (أرقام الضمان الاجتماعي) بالتعاون مع آليات إصلاح الحمض النووي الذاتية للتكامل المستهدفة من بناء مراسل في موضع AAVS1. بعد ترنسفكأيشن من أرقام الضمان الاجتماعي إلى hPSCs، نحن لشرح كيفية عزل السكان خلية إسوي إيواء مراسل.
القدرة على التعامل مع العوامل الوراثية، وتحديدا المحفزة وقف جينوم الخلية، وذلك باستخدام أرقام الضمان الاجتماعي ليست ظاهرة جديدة وفائدة nucleases إصبع الزنك (ZFNs) والنسخ activatوقد تجلى nucleases المستجيب أو مثل (TALENs) لتحرير الجين عدة سنوات قبل 10/4. ومع ذلك، مع ظهور S. المقيحة كريسبر / تكنولوجيا Cas9 11-13، أصبح التحرير الجينات يمكن الوصول إليها على نطاق واسع (14). جميع أرقام الضمان الاجتماعي إدخال مزدوج كسر DNA الذين تقطعت بهم السبل (DSB) في موقع الهدف المحدد 1،4،5،11 أن يتم إصلاحه من قبل الآليات الخلوية المحلية باستخدام إما غير مثلي إصلاح (NHEJ)، الانضمام إلى نهاية أو تناظر الموجهة (HDR) 15. NHEJ هو عرضة للخطأ ويمكن أن يعرض إطار الطفرات التحول مما أدى إلى فقدان وظيفة الجين، بينما HDR يسمح لعناصر جديدة إلى أن قدم من خلال التعاون ترنسفكأيشن من قالب إصلاح مع SSN. في حين يعتقد أن المبادئ الأساسية لإصلاح الحمض النووي التي تسهل التحرير الجينات أن يكون في حد ذاته لكل SSN، ويمكن ملاحظة بعض الاختلافات بين الأنظمة الأساسية. دي نوفو تصميم ZFNs يسمح المرونة ونوكلياز الأمثل 16، إلا أن استخدام علنامكتبات التجمع المتاحة وأدوات الفحص لتصميم ZFNs الفردية يمكن أن يكون مضيعة للوقت. مرة واحدة يتم تحديد مكان المطلوب لاستهداف ZFN بوساطة، أزواج ZFN يمكن تصميم مع شبكة الإنترنت أداة ZiFit 17. بعد تصميم، ZFNs يمكن تجميعها مجزأة من خلال عدة جولات من البلازميد الاستنساخ 18. بدلا من ذلك، هناك العديد من، ZFNs المصادق عليها مسبقا ومتوفرة تجاريا 19. ويمكن أيضا nucleases حكاية أن تصمم باستخدام أدوات الإنترنت والمكونات المتوفرة علنا 17،20. على سبيل المثال، TALENs يمكن تجميعها بسرعة من كتل خمسة يكرر حكاية، من خلال FLASH تجميع 21 أو باستخدام PCR أساس هرمي جولدن جيت التجمع 22. سهولة تصميم SSN وسرعة البناء باستخدام كريسبر / Cas9 جعلت الجينوم تحرير أداة يمكن الوصول إليها على نطاق واسع. دليل قصيرة بوساطة RNA استهداف كريسبر / Cas9 كما يسمح لمضاعفة من الرنا دليل لاستهداف عدة مواضع مع بناء واحد 14. التصميممن Cas9 لتحرير الجين يتطلب فقط التعرف على عزر المجاور protospacer (PAM؛ وثلاثي النوكليوتيد NGG لS. المقيحة Cas9) الأقرب إلى مكان الهدف. من خلال إدخال قليل النوكليوتيد الموافق 20 أزواج قاعدة 5 'من حزب الأصالة والمعاصرة في البلازميد px330 14، وبناء يمكن تجميعها في خطوة الاستنساخ واحد. بالإضافة إلى S. المقيحة Cas9، Cas9 من N. السحائية (NmCas9) أن يعترف 5'-NNNNGATT-3 "(PAM) وقد تبين للسماح للكفاءة الجينات التحرير في hPSCs 23.
بالإضافة إلى الاختلافات في سهولة تصميم SSN، كل منصة لديه خصائص معينة. على سبيل المثال، ZFNs وTALENs استخدام المجال نوكلياز FokI، الذي يولد أربعة النوكليوتيدات 5 'عبء 24 في حين يعتقد Cas9 لتوليد معظمهم فظة DSBs العضوية. ZFNs، TALENs، وCas9 تختلف في بثبات البروتين، ومعدل على الخروج على DNA الهدف، وطريقة المسح DNA، والتي جولد ينتج نظريا في الفروق الصغيرة في نتائج التحرير 1. في حين سيتم حاجة إلى مزيد من الدراسات لفهم كامل للعواقب هذه الخلافات، ونحن هنا وصف البروتوكول الذي هو قوي للغاية في جميع المنصات الثلاث، ويمكن استخدامها لتوليد بسهولة hPSCs المعدلة وراثيا.
بغض النظر عن اختيار SSN، Electroporation للهو إجراء قوي ل transfect أرقام الضمان الاجتماعي والقوالب إصلاح تناظر في hPSCs 25. عدد الباقين على قيد الحياة المستعمرات بعد اختيار المقاومة للمضادات الحيوية يعتمد على المعلمات مكان محدد واستراتيجية التحرير (على سبيل المثال، حجم إدراج المعدلة وراثيا وطريقة اختيار). بروتوكول الموصوفة هنا النتائج عادة في حوالي 150-400 المستعمرات وحيدة الخلية مشتقة.
وقد سبق أن استخدمت في موضع AAVS1 باستخدام هذا البروتوكول والتعديل الجيني لإثبات فعالية أرقام الضمان الاجتماعي 4،5. يستخدم قالب إصلاح AAV-CAGGS-EGFP فخ الجين شارعategy للتشاور المقاومة بوروميسين بطريقة محددة موضع. لفترة وجيزة، القالب الإصلاح يحتوي موقع متقبل لصق المنبع من كاسيت promoterless المقاومة بوروميسين. على الاندماج الصحيح في إنترون الأول من هذا الجين PPP1R12C في موضع AAVS1، وأعرب عن الكاسيت المقاومة من مروج الجين تحريرها و. متانة هذا الاختبار AAVS1 محددة تسمح لنا لمقارنة كفاءة كل منصة SSN.
التحرير الجينات باستخدام أرقام الضمان الاجتماعي هي قوية نظرا لقدرتها على تعطيل و / أو تعديل نظريا أي الجينات. تطبيق هذه الاستراتيجية إلى hPSCs يوفر براعة كما hPSCs يمكن أن تكون متباينة في وقت لاحق إلى العديد من أنواع الخلايا البشرية مثل الخلايا العصبية 26، 27 خلايا الكبد، والعضلية 28. بالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام يسببها الخلايا الجذعية المحفزة المشتقة من المريض يسمح للإصلاح أو إدخال تعرف الطفرات المسببة للأمراض في الخلفية الوراثية المريض محددة 29 </sup>، وتوفير منصة يمكن من خلالها تحقيق آليات المرض والعلاجات اختبار باستخدام خلايا المريض نفسه 30. باختصار، تحرير الجين في hPSCs هو نهج فعال وتنوعا للتحقيق في البيولوجيا الأساسية للتنمية البشرية ومرض 31.
الطريقة المعروضة هنا لعزل السكان متجانسة من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان في تحرير الجين هو طريقة فعالة لتوليد خطوط hPSC إسوي التي تختلف فقط في موضع المستهدفة. هذه الخلايا هي النظام المثالي لبحث آليات التمايز الخلوي البشري والتنمية وكذلك لفهم الفيزيولوجيا المرضية لأمراض أحادية المنشأ في وضع الجيني للرقابة. كما هو موضح هنا، فإنه من الممكن استخدام ثلاث استراتيجيات تصميم SSN المستقلة (ZFNs، TALENs، وكريسبر / Cas9) لتحقيق التكامل المستهدفة في موضع AAVS1. كل هذه المنهجيات مزاياه وعيوبه. وهناك ميزة محتملة من ZFNs و، إلى حد ما، TALENs هو مرونة تصميمها، والذي يسمح الهندسة متكررة من أجل تحسين DNA مجالات nucleases الفردية 42 ملزمة. هذا التحسين نوكلياز يمكن أن يزيد من خصوصية ZFNs وTALENs أبعد ما يمكن تحقيقه مع CRIنظام SPR / Cas9. قد تكون مثل هذه الانتقائية المهم للتطبيقات السريرية التي تتطلب درجة عالية من الدقة الهدف. والميزة الرئيسية لنظام كريسبر / Cas9 هو سهولة استخدامه. رغم ما بذل مجموعات بناء TALEN وZFN متاحة للجمهور (أي من خلال Addgene 21)، كريسبر / أرقام الضمان الاجتماعي القائمة على Cas9-هي أسهل بكثير لبناء، حيث أن التخصيص الضروري الوحيد هو 20 قاعدة الزوج قليل النوكليوتيد (عند استخدام البلازميد px330 تصميم 14). هذه البساطة يبرهن على أن تكون مفيدة للمختبرات الأبحاث تبحث لتشمل تحرير الجينوم في دراستهم.
هناك تقنيات ترنسفكأيشن البديلة، بما في ذلك nucleofection 43، لإنشاء خطوط hPSC تحرره الجينات. ومع ذلك فقد تبين Electroporation للأن تكون 4،5،25 فعالة بما يتفق والتكلفة. Nucleofection يمكن استخدامها ل transfect مباشرة Cas9-دليل المجمعات بروتين نووي ريبوزي RNA داخل النواة، وزيادة كفاءة وSSNد الاخلاص 44. تزايد hPSCs على MEFS هو وسيلة قوية وغير مكلفة للحفاظ على hPSCs في حالة المحفزة دون تمايز المفرط. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يسمح لعزل سهلة المستعمرات متطابقة وراثيا. بدلا من ذلك، فمن الممكن أن hPSCs ثقافة دون MEFS، ولكن هذه الظروف والثقافة يمكن أن يكون أكثر تكلفة من الثقافات على أساس التغذية. وعلاوة على ذلك، والعملية برمتها هي قابلة للتطوير، مما يتيح لعزل أحداث التحرير نادرة جدا أو توليد العديد من خطوط الخلايا المتميزة في موازية التجارب التحرير.
بروتوكول الموصوفة هنا هو القوي. ولكن هناك العديد من الخطوات الرئيسية التي تؤثر على الكفاءة التي استنساخ تحريرها بشكل صحيح يمكن الحصول عليها. العنصر الأكثر أهمية لهذا الأسلوب هو وجود MEFS ذات جودة عالية وMEFS DR4 المقاوم للأدوية. بقاء hPSCs واحدة هي واهية، وسوف MEFS ذات الجودة المنخفضة تعيق عزل خطوط hPSC غير متمايزة. ثانيا، استخدام Y-27632 أيضامفتاح للسماح للبقاء خلية واحدة دون توليد الضغط الانتقائي للخلايا مع النمط النووي الشاذ 45. ثالثا، اختيار المستعمرات متباعدة بشكل جيد يضمن التجانس الوراثي للخطوط الخلايا المشتقة. وأخيرا، من المهم إعداد الماصات الزجاجية بحيث تكون الفتحة صغيرة بما يكفي لكسر مستعمرة إلى العديد من القطع الصغيرة، وضمان أن مستعمرات متعددة سينمو في البئر الجديد. هذا يسمح للقطف من subclones متباعدة بشكل جيد لوحة طبق الأصل أن يكون في الثقافة، وترك لوحة أصلية للمستعمرات معزولة عن التنميط الجيني. جزء تحديا في هذا البروتوكول هو دليل سحب من الماصات الزجاج؛ هذا ينبغي أن يمارس مسبقا. وتجدر الإشارة إلى أن هناك تقنيات متعددة من استنساخ قطف التي لا تتطلب ماصة الزجاج. ويتم تشجيع المجربون للعثور على أحد أن يعمل على نحو أفضل بالنسبة لهم.
هناك قيود على هذا البروتوكول والتي يمكن التغلب عليها تعديلات بسيطة. تجربة تهدف إلى ستعطيل نلي موضع الاهتمام دون إصلاح أو الذين إصلاح القالب لا يحتوي على شريط التحديد، يجب استخدام طريقة أخرى لإثراء للخلايا التي تم تحريرها واحدة. لاحظ أن عدد المستعمرات التي يجب أن تكون التقطت للعثور على استنساخ إيجابي يزيد بشكل كبير في غياب التحديد. استراتيجية واحدة لتحسين كفاءة للمشاركة في transfect البلازميد غير إدماج التي تعبر عن بروتين فلوري. بعد السماح للخلايا لاسترداد لمدة يومين، والخلايا المستهدفة يمكن فرزها في مضان الإيجابي باستخدام مضان تنشيط الخلايا الفرز وreplated 29. هذه العملية تغني عن الخلايا التي تم مع transfected البلازميدات بواسطة الصعق الكهربائي ويزيد من احتمال حدوث الحدث التحرير المتزامن في الخلية وبالتالي.
الأساليب المذكورة هنا يمكن أن تمتد إلى استخدام الرنا دليل متعددة في وقت واحد لاستهداف عدة مواضع 14،46،47. وقد أنشئت العديد من البروتوكولات للتمييز hPSCsإلى أنواع الخلايا متميزة، مما يتيح التلاعب الجيني مختلفة في أنواع الخلايا التي تهم 30. عموما، لقد أثبتنا إمكانية تحرير الجينوم كفاءة في hPSCs بغض النظر عن اختيار SSN. نقترح أن هذا الأسلوب يمكن تكييفها لإنشاء خطوط hPSC إسوي التي تم تحريرها الجينات في أي مكان الجيني.
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من خلال منحة البذور مؤسسة أبحاث الدماغ (BRFSG-2014-02) إلى هيلين Bateup. ديرك Hockemeyer هو الباحث العلمي الجديد في الشيخوخة من مؤسسة إليسون الطبية وبدعم من مؤسسة جلين فضلا عن وShurl ومؤسسة كاي كورسي ليودع. ويدعم DH أيضا منحة المعاهد الوطنية للصحة 1R01CA196884-01.
DMEM/F12 | Life Technologies | 11320082 | |
Fetal Bovine Serum (HI) | Life Technologies | 10082-147 | |
Knockout Serum | Life Technologies | 10828-028 | |
Fibroblast Growth Factor – basic | Life Technologies | PHG0261 | |
Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | |
Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | |
2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
Y-27632 | Calbiochem | 688000 | |
6-well plates | Corning | 3506 | |
12-well plates | Corning | 3512 | |
4mm Electroporation cuvettes | Bio-rad | 165-2081 | |
X-cel gene pulser II | Bio-rad | 165-2661 | |
0.25 % Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
10× Phosphate buffered saline (PBS) pH7.4 | Life Technologies | 70011-044 | |
Puromycin | Life Technologies | A11138-02 | |
Pasteur pipettes, plugged | VWR | 14672-412 | |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | S5941 | |
NaCL | Sigma-Aldrich | S9888 | |
SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
Proteinase-K | Life Technologies | AM2544 | |
Ethanol | VWR | TX89125-172SFU | |
Isopropyl Alcohol | VWR | MK303216 | |
TE Buffer | Life Technologies | 12090-015 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
1.8 ml Cryotubes | ThermoScientific | 377267 |