JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia do Desenvolvimento

Establecimiento de editados-Genoma Humano pluripotentes Líneas de Células Madre: De Focalización de Aislamiento

Published: February 02, 2016
doi:
10.3791/53583
, ,
1Department of Molecular and Cell Biology,University of California, Berkeley

Summary

Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance.

Abstract

Genoma de edición de células madre pluripotentes humanas (hPSCs) proporciona una plataforma controlada genéticamente y clínicamente relevante de la que para comprender el desarrollo humano e investigar la fisiopatología de la enfermedad. Mediante el empleo de nucleasas específicas del lugar (SSN) para la edición del genoma, la rápida derivación de nuevas líneas HPSC albergan alteraciones genéticas específicas en un entorno de lo contrario isogénico se hace posible. Zinc dedo nucleasas (ZFNs), transcripción nucleasas tipo activador efectoras (Talens) y agrupados espaciadas regularmente repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR) / Cas9 son los números de seguro social más utilizados. Todas estas nucleasas funcionan mediante la introducción de un descanso de ADN de doble cadena en un sitio determinado, promoviendo así la edición gen precisa en un locus genómico. Edición genoma meditado-SSN explota dos de los mecanismos de las células endógenas de reparación del ADN, de extremos no homólogos de unión (NHEJ) y homología de reparación dirigido (IDH), ya sea a introducir de inserción / deleción mutaciones o alter el genoma utilizando una plantilla de reparación homóloga en el sitio de la rotura de doble cadena. Electroporación de hPSCs es un medio eficaz para la transfección de números de Seguro Social y las plantillas de reparación que incorporen transgenes tales como reporteros fluorescentes y casetes de resistencia a antibióticos. Después de la electroporación, es posible aislar sólo aquellos hPSCs que incorporaron el constructo de reparación mediante la selección para la resistencia a los antibióticos. Para separar mecánicamente colonias HPSC y confirmando la integración adecuada en el sitio diana a través de genotipado permite el aislamiento de líneas celulares correctamente orientadas y genéticamente homogéneos. La validez de este protocolo se demuestra aquí utilizando las tres plataformas SSN incorporar EGFP y una resistencia a puromicina construyen en el locus puerto seguro AAVS1 en células madre pluripotentes humanas.

Introduction

Tecnologías de edición Genoma están evolucionando rápidamente en herramientas estándar de biología molecular y celular 1. La ingeniería genética de las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) es de particular interés ya hPSCs representan una fuente de auto-renovación de células humanas primarias genéticamente intactos. hPSCs pueden diferenciarse en diversos tipos de células para el modelado de la enfermedad o como una fuente para las terapias de trasplante de 2,3. Ha demostrado aquí es un protocolo que utiliza tres tipos diferentes de nucleasas específicas de sitio (SSN) en conjunción con los mecanismos de reparación del ADN endógeno para la integración dirigida de un constructo indicador en el locus AAVS1. Después de la transfección de los SSN en hPSCs, demostramos cómo aislar poblaciones de células isogénicas albergar el reportero.

La capacidad de manipular genomas, específicamente los genomas de células madre pluripotentes, utilizando los SSN no es un nuevo fenómeno como la utilidad de nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) y activat transcripciónnucleasas efectoras o similares (Talens) para la edición de genes se demostró hace varios años 4-10. Sin embargo, con el advenimiento de S. pyogenes CRISPR / tecnología Cas9 11-13 de la edición gen se ha convertido en ampliamente accesible 14. Todos los números de Seguro Social introducen una ruptura del ADN de doble cadena (DSB) en el sitio 1,4,5,11 destino especificado que está reparado por mecanismos celulares endógenos usando reparará extremo de unión (NHEJ) u homología dirigida no homóloga (IDH) 15. NHEJ es propenso a errores y se puede introducir mutaciones cambio de marco resulta en la pérdida de la función génica, mientras HDR permite nuevos elementos para ser introducidos a través de la co-transfección de una plantilla de reparación con el SSN. Mientras que los principios subyacentes de la reparación del ADN que facilitan la edición gen se cree que son en gran parte los mismos para cada SSN, algunas diferencias entre las plataformas pueden tenerse en cuenta. De novo diseño de ZFNs permite la flexibilidad y la nucleasa de optimización 16, sin embargo el uso de públicamentebibliotecas de montaje disponibles y herramientas de evaluación para diseñar ZFNs individuales pueden llevar mucho tiempo. Una vez determinado el lugar deseado para la orientación mediada por ZFN, pares ZFN pueden ser diseñados con la herramienta en línea ZiFit 17. Después de diseño, ZFNs se puede montar de forma modular a través de varias rondas de clonación plásmido 18. Alternativamente, hay muchas ZFNs disponibles comercialmente, pre-validado 19. Nucleasas TALE también pueden ser diseñados utilizando herramientas en línea y componentes disponibles públicamente 17,20. Por ejemplo, Talens se puede montar rápidamente de bloques de cinco repeticiones TALE, a través del conjunto FLASH 21 o el uso conjunto de la puerta de oro de PCR basada jerárquica 22. Facilidad de diseño SSN y la velocidad de la construcción utilizando CRISPR / Cas9 han hecho genoma editar una herramienta ampliamente accesible. La guía breve orientación ARN mediada de CRISPR / Cas9 también permite la multiplexación de los ARN de guía para orientar varios loci con una única construcción 14. El diseñoCas9 para la edición de gen sólo requiere la identificación de un motivo adyacente protospacer (PAM; un trinucleótido NGG para S. pyrogenes Cas9) proximal para el locus diana. Mediante la inserción de un oligonucleótido que corresponde a los pares de bases 20 5 'de la PAM en el plásmido px330 14, el constructo se puede montar en un solo paso de clonación. Además de S. pyogenes Cas9, Cas9 de N. meningitidis (NmCas9) que reconoce a '(PAM) 5'-NNNNGATT-3 se ha demostrado para permitir la eficiente gen de edición en hPSCs 23.

Además de las diferencias en la facilidad de diseño SSN, cada plataforma tiene propiedades específicas. Por ejemplo, ZFNs y Talens utilizan el dominio nucleasa FokI, que genera una de cuatro nucleótidos 5 'voladizo 24, mientras que Cas9 se piensa sobre todo para generar embotar DSBs terminado. ZFNs, Talens, y Cas9 difieren en sus estabilidades de proteína, la tasa de encendido y apagado en el ADN objetivo, y el modo de exploración de ADN, todos los cuales could teóricamente dar lugar a pequeñas diferencias en el resultado de edición 1. Aunque se necesitan más estudios para comprender plenamente las consecuencias de estas diferencias, se describe aquí un protocolo que es muy robusto en las tres plataformas y se puede utilizar para generar fácilmente hPSCs modificados genéticamente.

Independientemente de la opción SSN, electroporación es un procedimiento robusto para transfectar SSN y plantillas de reparación de homología en hPSCs 25. El número de colonias supervivientes después de la selección para la resistencia a los antibióticos depende de los parámetros específicos de locus y la estrategia de edición (por ejemplo, el tamaño del inserto transgénico y el modo de selección). El protocolo descrito aquí por lo general se traduce en unos 150 a 400 colonias de células individuales derivados.

Gen-editando en el locus AAVS1 usando este protocolo se ha utilizado anteriormente para demostrar la eficacia de los SSN 4,5. La plantilla de reparación de AAV-CAGGS-EGFP utiliza una trampa de genes strategia para conferir resistencia a puromicina de una manera específica locus. Brevemente, la plantilla de reparación contiene un sitio aceptor de empalme aguas arriba de la casete de resistencia a puromicina sin promotor. Tras la integración correcta en el primer intrón del gen PPP1R12C en el locus AAVS1, la casete de resistencia se expresa a partir del promotor del gen editado. La solidez de este ensayo AAVS1 específica nos permite comparar la eficiencia de cada plataforma SSN.

Edición de genes usando números de seguro social es de gran alcance, dada la capacidad de alterar y / o modificar teóricamente cualquier gen. La aplicación de esta estrategia para hPSCs ofrece versatilidad como hPSCs pueden diferenciarse posteriormente en una multitud de tipos de células humanas tales como las neuronas 26, hepatocitos 27, 28 y cardiomiocitos. Además, el uso de células madre pluripotentes inducidas derivados del paciente permite la reparación o la introducción de mutaciones causantes de enfermedad conocidos en un fondo genético específico del paciente 29 </sup>, Proporcionando una plataforma para investigar mecanismos de la enfermedad y la terapéutica de prueba utilizando las propias células del paciente 30. En resumen, la edición de genes en hPSCs es un enfoque eficiente y versátil para la investigación de la biología básica del desarrollo humano y la enfermedad 31.

Protocol

Los procedimientos descritos en este manuscrito fueron revisados ​​y aprobados por el Comité de Supervisión de la Investigación Universidad de Berkeley de Células Madre. 1. Preparar las células madre para la edición Crecer y cultivar células madre pluripotentes humanas (hPSCs) en una placa de 6 pocillos que contiene 2,4 × 10 6 células / plato de ratón inactivado-C mitomicina fibroblastos embrionarios (MEF) alimentadores cultivadas en gelatina 32. Mantener hPSCs en 3 ml de medio de células madre de embriones humanos por pozo (medios hESC) y crecer en un 37 ° C incubadora con 3% O 2/5% de CO 2. Nota: Para el éxito de este protocolo, no es necesario mantener hPSCs en una incubadora de bajo oxígeno; sin embargo, es importante señalar que hPSCs proliferan más rápidamente en un entorno de alto O 2, por lo que los tiempos y el número de células se deben ajustar en consecuencia. También hay que señalar que hPSCs mantienen en bajos niveles de oxígeno tienen menores tasas de diferenciación espontánea 33. To hacer que los medios de comunicación 500 ml hESC combinan 380 ml de DMEM / F12, 75 ml de suero fetal bovino (FBS), 25 ml KnockOut suero de Reemplazo (KSR). Añadir glutamina (1 mM concentración final), 5 ml 100x ácidos no esenciales Amino, 100 unidades / ml penicilina-estreptomicina (P / S), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) (4 ng / ml de concentración final), y 2- mercaptoetanol (5,5 M concentración final). Cambie los medios de comunicación mediante la eliminación de todo el volumen de los medios de comunicación (3 ml) con una pipeta de vidrio y de vacío. Reemplazar con medios hESC 3 ml tibia con una pipeta serológica. Repita los medios cambian todos los días hasta hPSCs son aproximadamente el 50% de confluencia (día -1). Un día antes de la orientación (día -1), cambiar los medios de comunicación células madre, la eliminación de los viejos medios de comunicación y la adición de los medios de comunicación de células madre cálidos suplementado con 10 mM Y-27632. También el día -1, preparar una o dos placas de 6 pocillos o de 10 cm de resistentes células alimentadoras MEF drogas de ratones DR4 (2,4 × 10 6 células / placa) 34. Nota: En general, las placas de 6 pocillos son adventajosos más de 10 platos cm, ya que acomodan más medios. 6 placas así también garantizar que los diferentes clones de diferentes pozos son independientes. Sin embargo, una placa de 10 cm permitirá picking más fácil, dependiendo del microscopio disponible para este proceso. 2. Edición de células madre pluripotentes Preparar soluciones de transfección pipeteando 5 g cada uno de ZFN 1 y 2, TALEN 1 y 2, o 15 g de la CRISPR / Cas9 plásmido que codifica px330 (Figura 1) en un tubo de 1,5 ml. Pipetear 30 g del plásmido de reparación en este tubo también. Por último, la pipeta 1x tampón fosfato salino (PBS) en el tubo para llevar el volumen hasta 300 l. Nota: Preparar plásmidos como un midiprep (cualquier kit es adecuado) con una concentración mínima de 300 ng / l con el fin de mantener el volumen total de la solución de transfección de menos de 300 microlitros. No es necesario para llevar a cabo la extracción con fenol / cloroformo, para linealizar el plásmido, o utilizar un endotokit de preparación plásmido libre xin. Retire el medio de hPSCs utilizando una pipeta de vidrio y de vacío. Pipeta 2 ml de PBS 1x caliente en cada pozo para lavar las células. Retire la PBS de inmediato con una pipeta de vidrio y de vacío. Añadir solución de tripsina-EDTA 0,5 ml 0,25% directamente sobre las células en cada pocillo. Colocar en la incubadora (37 ° C / 5% de CO 2/3% O 2) durante aproximadamente 10 min. o hasta capa de alimentación comienza a levantar la placa. Añadir 2 ml de medio caliente esWash (470 ml DMEM / F12, 25 ml de FBS, 100 unidades / ml P / S) a cada pocillo para detener la reacción tripsina. Asegurar que las células alimentadoras salir como una hoja. Pipetear los contenidos de cada pocillo en un único tubo cónico de 50 ml, la combinación de todos los pocillos. Células usando un triturado en 10 ml pipeta serológica. No es necesario para romper la capa de alimentación; hPSCs se desprenderá de la capa de alimentación por trituración suave. No debe ser de unos 15 ml de la suspensión celular. Añadir 25 ml de medio esWash al tubo para llevar el voluyo hasta 40 ml en total. Permitir que grandes trozos de alimentación se asienten en el fondo del tubo de 1-2 min. Eliminar el sobrenadante (~ 38 ml) del tubo utilizando una pipeta serológica y depositar en un nuevo tubo cónico de 50 ml. Centrifugar durante 5 minutos a 190 x g. Eliminar el sobrenadante del tubo usando una pipeta de vidrio y de vacío. Asegúrese de no perturbar el sedimento celular. Resuspender las células en 500 l de 1x PBS. Combinar con solución de transfección del plásmido preparado con anterioridad. Contar las células en este paso. Utilice 5-10 millones de células por electroporación. Pipetear toda la suspensión de 800 l en una cubeta de electroporación de 4 mm, colocar en hielo durante 3-5 minutos. Electroporar células utilizando el programa exponencial en el sistema de electroporación con los siguientes parámetros: 250 V, 500 mF, ∞ resistencia, y 4 mm de tamaño de cubeta. Después de la electroporación, coloque la cubeta de nuevo en hielo durante 3 min. Nota: Tenga en cuenta la constante de tiempo de la electroporación en el sistema de electroporación. La constante de tiempovaría con el número de células y la pureza del ADN. Transfecciones exitosos por lo general tienen un tiempo constante entre 10 a 14 ms cuando se utilizan las condiciones mencionadas y un pulsador de genes II. Bajar las eficiencias de electroporación pueden ocurrir cuando constantes de tiempo varía de estos valores. Resuspender las células electroporadas en 18 ml cálida hESC medio suplementado con 10 mM Y-27632. Placa 3 ml de esta suspensión de células individuales en cada pocillo de una placa de 6 pocillos con células alimentadoras DR4. Retorno a la incubadora (37 ° C / 5% de CO 2/3% O 2). 3. Selección de colonias positivas Día 2, quite todos los medios de comunicación utilizando una pipeta de vidrio y de vacío. Reemplazar con 3 ml de medio de células madre cálidos suplementado con 10 mM Y-27632. Día 3, quite todos los medios de comunicación utilizando una pipeta de vidrio y de vacío. Reemplace con 3 ml de medio de células madre cálida sin incluir Y-27632. Día 4, quite todos los medios de comunicación utilizando una pipeta de vidrio y de vacío. Reemplace con 3 ml de medio de células madre cálidos suplementado con antibióticos para selectien. Retorno a la incubadora (37 ° C / 5% de CO 2/3% O 2). Nota: El tipo de antibiótico que se usa dependerá de la casete de resistencia incluido en la plantilla de reparación. Cuando se trabaja con WIBR # 3 hPSCs (NIH registro 0079), 0,5 mg / ml de puromicina, 70 mg / ml de G418 (geneticina), y 35 mg / ml de higromicina se han utilizado con éxito. Las concentraciones de la selección deben determinarse empíricamente mediante el establecimiento de la concentración mínima de antibiótico necesaria para matar las células de tipo salvaje en un plazo aproximado de una semana. Días 5-12, cambian los medios de comunicación todos los días, en sustitución de los viejos medios cada vez con medios hESC cálidos suplementado con antibióticos. Nota: esperar una gran cantidad de muerte celular. Las colonias individuales se pondrán de manifiesto en torno días 8-10. Medios hESC Regular sin antibióticos se puede utilizar después de 12-14 días de selección continua. Si la densidad celular es alta o la muerte celular es lenta, la acidificación de los medios de comunicación debe ser evitado y que puede ser necesario aumentar las volu mediosme (hasta 4-5 ml) durante los primeros días de la selección. 4. Recoger las colonias seleccionadas (día 12-14) Observe colonias en días 12-14. Observe las colonias que están listos para recoger en un microscopio de disección y asegurarse de que no contienen células que empiezan a diferenciarse. El tamaño aproximado debe ser 800-1.200 M. Si colonias alcanzan este tamaño antes del día 12, se recomienda que deben ser recogidos a continuación. Nota: Para cada experimento dirigido, recoger la mayor cantidad de colonias como sea necesario para asegurar el genotipo deseado se aísla. Como ejemplo, la edición AAVS1 con la plantilla de reparación de AAV-CAGGS-EGFP ha demostrado consistentemente la integración robusta, y requiere sólo 12-24 colonias para ser recogidos para obtener aproximadamente 5-10 clones heterocigótica dirigidos. Otros experimentos dirigidos pueden requerir más colonias para ser recogidos (Tabla 1). La frecuencia de los eventos de segmentación correcta, depende de factores tales como la eficiencia de la SSN para introducir un OSD, el tamaño de inserción, y la estrategia de selección. En el caso del enfoque de trampa de genes para el locus AAVS1 que aquí se presenta, el marcador de selección sólo se expresa cuando se integra correctamente en el sitio diana, reduciendo el número de colonias requerido para obtener un clon correctamente orientado. Un día antes de recoger, preparar placas de 12 pocillos de MEFs (2,4 × 10 6 células / placa, un pozo se utilizarán para cada colonia recogido). En el día de la recolección, retire todos los soportes de las placas de 12 pocillos MEF utilizando una pipeta de vidrio y de vacío y reemplazar con 1 ml de medio de células madre. También el día de la recolección, cambiar los medios de comunicación células madre en las placas de 6 así que van a ser recogidos. Tire pipetas de vidrio para la disociación mecánica de colonias individuales de la capa alimentadora. Baje las pipetas sobre un mechero Bunsen en el capó y suavizado en el punto de expansión hasta que el vidrio es maleable. Quitar rápidamente del fuego y tirar la pipeta creando además un punto angular. Rompe elapuntar aproximadamente 2 cm desde el eje doblado, dejando un estrecho canal. Pulir el extremo del canal mediante la exposición a la llama durante 1-2 seg. Nota: Opcionalmente recoger colonias una punta de pipeta p20, sin embargo, esto puede reducir la clonalidad de la cultura, como la punta embotada puede desalojar mayores cantidades de células de cada colonia en los medios de comunicación, potencialmente contaminante cosechas posteriores. Montar dispositivo de recogida mediante la adopción de una punta de pipeta filtro p1000 y adjuntando un bulbo de succión al extremo estrecho. Inserte la pipeta de vidrio tirado en el extremo ancho. Coloque una placa de 6 pocillos de hPSCs a ser recogido en el escenario de un microscopio de disección montada en una campana de cultivo de tejidos. Comprimir la bombilla del dispositivo de recogida y extirpar con cuidado y cortar una colonia individual en 10-20 piezas de igual tamaño, con cuidado de no soltar piezas en los medios de comunicación. Tome extirpados piezas HPSC de la colonia en la pipeta por la liberación de la bombilla. Trate de tomar tan poco como sea posible los medios de comunicación durante la transferencia. Transfer la colonia individual a un solo pocillo de una placa de 12 pocillos MEF, comprimiendo el bulbo de nuevo directamente en el pozo, la liberación de la colonia ahora roto. Etiquete cada pocillo para permitir la identificación única de una sola célula clones derivados. Repita el procedimiento para el mayor número de colonias como sea necesario, el cambio de la pipeta de vidrio cada vez. Nota: Las colonias de la cosecha puede tomar algún tiempo para aprender. Se recomienda que la práctica experimentador en algunas células de control antes de intentar aislar colonias específicas. Volver placas de 12 pocillos a la incubadora (37 ° C / 3% O 2/5% de CO 2), meciéndose suavemente la placa primero para evitar la acumulación de las células en el medio de cada pocillo. Al día siguiente y cada día subsiguiente, eliminar todo volumen de los medios de comunicación con una pipeta de vidrio y de vacío y reemplazan con 1,5 ml de medio de células madre caliente hasta que las células son aproximadamente el 50% de confluencia (esto tarda generalmente 10-12 días). Después de 10-12 días, elegir uno de dos colonias de cada pocillo y transferir a los nuevos 12 pozos placas MEF repeating pasos 4.1 a 4.8 para generar una placa de réplica. Extracto de ADN (véase a continuación) a partir de las colonias restantes en cada pocillo de las placas MEF originales. Retire los medios de comunicación de todos los pozos utilizando una pipeta de vidrio y de vacío. Pipeta 1 ml de PBS 1x en cada pozo para lavar las células. Retire PBS con una pipeta de vidrio y de vacío. Pipetear 250 l de tampón de lisis celular (concentraciones finales en H 2 O: Tris HCl 10 mM, EDTA 5 mM, 0,2% de SDS, NaCl 200 mM, 0,08 mg / ml de proteinasa-K) en cada pocillo. Colocar en incubadora (37 ° C / 3% O 2/5% de CO 2) O / N. Al día siguiente, los contenidos de cada pocillo de pipeta en tubos de 1,5 ml individuales. Pipetear 250 l de alcohol isopropílico en cada tubo para precipitar el ADN. Agitar el tubo vigorosamente. Un precipitado blanco debe ser visible. Haga girar cada tubo hacia abajo durante 3 minutos a 13.000 rpm en una centrífuga de mesa. Después de la vuelta abajo, desechar el sobrenadante por decantación en los residuos líquidos. Un pequeño sedimento de ADN debe permanecer pegada al fondo deel tubo. Pipetear 250 l de etanol al 70% en cada tubo para lavar el sedimento de ADN. Agite vigorosamente. Haga girar cada tubo hacia abajo durante 3 minutos a 13.000 rpm en una centrífuga de mesa. Después de girar hacia abajo, desechar el sobrenadante por decantación en los residuos líquidos. Un pequeño sedimento de ADN debe permanecer pegado a la parte inferior del tubo. Pipetear a cabo el resto del sobrenadante así que no hay líquido que queda en el tubo. Deja tubo abierto a secar en mesa de trabajo durante 5-10 minutos. Después del secado, resuspender el ADN en tampón TE 250 l. Coloca a 37 ° C durante 6 horas para permitir que el ADN se disuelva. Genotipo cada muestra utilizando una estrategia de transferencia de pre-optimizado PCR o el sur. Nota:.. Para AAVS1 focalización mediante la plantilla de reparación AAV-CAGGS-EGFP, la estrategia de transferencia de Southern se puede encontrar en Hockemeyer et al, 2009 4 Un protocolo integral transferencia de Southern se puede encontrar en el sur de 2006 35 Para multiplex PCR genotipificación de. el mismo experimento, cebadores y condiciones pueden serencontrado en la Tabla 2 36. Deseche los pozos que no están adecuadamente dirigidos y continuar cambiando los medios de comunicación células madre en células adecuadamente dirigidos todos los días. Congele por las células cuando son aproximadamente el 50% de confluencia, ver más abajo para la congelación de protocolo. Un día antes de la congelación, cambiar de medios de células madre, la eliminación de los viejos medios de comunicación y la adición de los medios de comunicación de células madre cálidos suplementado con 10 mM Y-27632. En el día de la congelación preparar 0,5 ml cada una de solución A y la solución B por pocillo de una placa de 12 pocillos que se está congelado en dos tubos cónicos de 15 ml. Soluciones Coloque sobre hielo. Solución A: 50% de células madre medios de comunicación y el 50% de SFB; Solución B: 80% de FBS y 20% dimetilsulfóxido (DMSO). Disociar colonias HPSC en células individuales antes de la congelación. Siga los pasos 2.2-2.8 para hacer esto, escalando volúmenes en consecuencia. Sedimento celular totalmente resuspender en 0,5 ml de solución A. Añadir 0,5 ml de solución B a la suspensión de células, la pipeta hacia arriba y abajo para que la suspensión celular homogénea. Take el volumen total de la suspensión de células (~ 1 ml) y depositar en un criotubo 2 ml. Tornillo tapa firmemente. Lugar criotubo en un congelador a -80ºC O / N. El día después de la congelación, a eliminar las células congeladas de -80 ° C congelador y colocar inmediatamente en el tanque de nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo.

Representative Results

Aquí se demuestra un protocolo compatible con tres plataformas SSN diferentes para crear por ingeniería genética líneas HPSC. Nos enfocamos WIBR # 3 células madre de embriones humanos en el locus AAVS1 usando ZFNs publicados anteriormente 4, 5 y Talens CRISPR / Cas9s 37 utilizando una plantilla de reparación que introduce un reportero EGFP y un casete de resistencia a puromicina 4. Nosotros cultivamos nuestros hPSCs en MEFs para un flujo de trabajo de cultivo celular que permite el mantenimiento y expansión de hPSCs no diferenciadas (Figura 2), que también es rentable y escalable. Si las células se cultivan más de lo necesario, existe el riesgo de un aumento de la diferenciación, lo que reduce el número de células pluripotentes que se transfecta y en consecuencia el número de colonias HPSC correctamente orientados obtenidos. Nos electropcorporado 5.0 x 10 6 células por plataforma SSN y chapado en las células de cada objetivo en una sola placa de 6 de DR4 MEFs. Después de la selección, cada plataforma resultó en colonias EGFP-positivas (Figura 3) y una combinación de clones no focalizados, homocigótica y heterocigótica específicas dirigidas (Figura 4A, B, Tabla 3). En las condiciones que se presentan aquí, nos encontramos con que la AAVS1 Talens resultó en la mayoría de los clones EGFP-positivas. La plantilla de reparación utilizado para este experimento consiste en un sitio aceptor de empalme aguas arriba del casete reportero y resistencia a la puromicina EGFP. Usando esta estrategia "gen-trampa" (Figura 1), el constructo debe insertar en el primer intrón del locus AAVS1, utilizando el promotor endógeno para conducir la expresión del casete de resistencia a puromicina. La falta de un promotor que dirige la expresión del gen de resistencia a puromicina dentro de la plantilla de reparación debe evitar la expresión en el evento de integración aleatoria. Por lo tanto, esperamos que todos los clones resistentes a la puromicina se destinarían en el sitio AAVS1. Cabe señalar que un subconjunto de clones llevar integraciones aberrantes en el locus AAVS1 que son detectables por Southern blot utilizando una sonda interna, pero no por la mayoría de las estrategias de PCR (Figura 1; Figura 4C) 4. Estos eventos de integración son muy probablemente el resultado de acontecimientos dirigidos heterólogos que conducen a múltiples integraciones del plásmido donante 4. Escogimos 24 colonias de cada experimento SSN y encontró que todas las plataformas tuvieron eficiencias muy altas de focalización y mostraron sólo diferencias mínimas. Como interrogado por PCR, CRISPR / Cas9 dado los clones más correctamente dirigida, mientras que la plataforma TALEN tenía los clones más homocigóticamente específicas (Tabla 3). /files/ftp_upload/53583/53583fig1highres.jpg "width =" 700 "/> Figura 1. Esquema del gen editado locus AAVS1 utilizando la plantilla de reparación AAV-CAGGS-EGFP. Modificado de Hockemeyer et al., 2009. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2. Las colonias de células WIBR # 3. Imágenes de campo claro representativos de colonias de WIBR # 3 células madre de embriones humanos antes de la orientación. Tenga en cuenta la falta de diferenciación y la clara separación de la capa de alimentación en una colonia de ideales (izquierda) frente a uno no ideal (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3. EGFP-positivas WIBR # 3 células. Imágenes representativas de WIBR # 3 células diana con una plantilla de reparación EGFP-expresión en el locus AAVS1. Imágenes de colonias representativas editadas con ZFNs, Talens y CRISPR / Cas9 se muestran. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4. estrategias de genotipado para confirmar la orientación correcta. (A) genotipo resultados Representante de PCR que muestran clones específicos focalizados, heterocigotos y homocigotos en las tres plataformas SSN. WT CTL = control de tipo salvaje. (B) Repreresultados Southern blot representativas que muestran un heterocigoto dirigida clon y un clon objetivo homocigotos detectó con sonda externa a 3 '. Tamaños de los fragmentos: WT-6,5 kb, Editado-6,9 kb. (C) Resultados de Southern blot representativo que muestra un clon correctamente editado y un clon heterocigoto con un doble integración no aleatoria. Tamaños de los fragmentos:. Correctamente editados-6,9 kb, aberrante adicional integración-5 kb Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Estudiar Gen diana Plataforma Reparación tipo de plantilla Nº de clones recogidos Eficiencia Orientación Sexton et al., 2014 TPP1 ZFN GFP-Puro </td> no declarada no declarada Sexton et al., 2014 De TERT ZFN Higromicina no declarada no declarada Hockemeyer et al., 2009 POU5F1 ZFN GFP-Puro 31 39,0% Hockemeyer et al., 2009 Pitx3 ZFN GFP-Puro 74 14,9% Hockemeyer et al., 2011 POU5F1 TALEN GFP-Puro 68 91,0% Hockemeyer et al., 2011 Pitx3 TALEN GFP-Puro 96 13,0% Merkle et al., 2015 VASA Cas9 Reportero-Geneticina 139 94,0% Merkle et al. </em>, 2015 CRH Cas9 Reportero-Geneticina 30 93,0% Merkle et al., 2015 HCRT Cas9 Reportero-Geneticina 154 92,0% Merkle et al., 2015 HMX2 Cas9 Reportero-Geneticina 11 45,0% Forster et al., 2014 LRG5-Nterm ZFN GFP-Puro no declarada 30,0% Forster et al., 2014 LRG5-Cterm ZFN GFP-Puro no declarada 14,0% Soldner et al., 2011 SNCA ZFN Puro 96 1,0% Tabla 1. Descripción de otros genes dirigida utilizando este método, con correcorres- focalización eficiencia tomadas de estudios publicados anteriormente. 4,5,38-41 Lugar Secuencia Notas AAVS1-F imprimación CTCTAACGCTGCCGTCTCTC Las condiciones de PCR: T m = 57 ° C, 35 ciclos AAVS1-WT-R imprimación GCTTCTCCTCTTGGGAAGTG Banda WT: 1.273 pb AAVS1 Targeted-R-imprimación CGTCACCGCATGTTAGAAGA Banda dirigida: 992 pb T2-Cas9-guía GGGCCACTAGGGACAGGAT Malí et al., 2013 AAVS1-ZFN-Derecha TAGGGACAGGAT De Hockemeyer et al., 2009 AAVS1-ZFN-Izquierda TGGGGTGTCACC De Hockemeyer et al., 2009 AAVS1-TALEN-Derecha TCCTAACCACTGTCTTT De Hockemeyer et al., 2011 AAVS1-TALEN-Izquierda CCCCTCCACCCCACAGT De Hockemeyer et al., 2011 Tabla 2. Lista de cebadores y SSN secuencias de direccionamiento. Orientación Construir Número de EGFP + Colonias Clones recogidos focalizados (PCR verificado) Anterior Reportado Eficiencia focalización correcta (por Southern blot) ZFN 150 86,9% (73,9% het / 13,0% homo) 56% (50% het / 6% homo) TALEN 412 91,3% (47,8% het / 39,1% homo) 47% (37,5% het / 9,3% homo) CRISPR-Cas9 235 95,7% (69,5% het / 26,3% homo) no declarada Tabla 3. números comparativos de EGFP-positivas y dirigidos TALEN, ZFN y CRISPR / colonias de células madre humanas Cas9. PCR verifican integraciones en el locus AAVS1 para este experimento se comparan con Southern blot verificado integraciones individuales adecuadas en experimentos anteriores 4,5.

Discussion

El método que aquí se presenta para el aislamiento de poblaciones homogéneas de células madre pluripotentes humanos de genes-editado es un enfoque poderoso para la generación de líneas isogénicas HPSC que se diferencian sólo en el locus diana. Estas células son un sistema ideal para sondear los mecanismos de la diferenciación celular y el desarrollo humanos, así como para la comprensión de la fisiopatología de las enfermedades monogénicas en un entorno genético controlada. Como se ha demostrado aquí, es posible utilizar independientes tres estrategias de diseño SSN (ZFNs, Talens, y CRISPR / Cas9) para lograr la integración dirigida en el locus AAVS1. Cada una de estas metodologías tiene sus propias ventajas y desventajas. Una ventaja potencial de ZFNs y, en cierta medida, Talens es su flexibilidad de diseño, lo que permite la ingeniería iterativo con el fin de mejorar los dominios de nucleasas individuales 42 de unión a ADN. Esta optimización nucleasa podría aumentar la especificidad de ZFNs y Talens más allá de lo que se puede lograr con el CRISistema de SPR / Cas9. Tal selectividad puede ser importante para aplicaciones clínicas que requieran un alto grado de especificidad de diana. La ventaja principal del sistema / Cas9 CRISPR es su facilidad de uso. Aunque kits de construcción TALEN y ZFN se han puesto a disposición del público (es decir, a través de Addgene 21), / SSN basados ​​Cas9 CRISPR son significativamente más fáciles de construir, como la única personalización necesaria es un par de oligonucleótidos 20 base (cuando se utiliza el plásmido px330 diseño de 14). Esta simplicidad resulta ser ventajoso para los laboratorios de investigación que buscan incluir la edición genoma en sus estudios.

Hay técnicas de transfección alternativos, incluyendo nucleofection 43, para crear genes editado HPSC líneas; Sin embargo electroporación ha demostrado ser eficaz 4,5,25 consistente y costo. Nucleofection se puede utilizar para transfectar directamente Cas9-guía complejos de ribonucleoproteínas ARN en el núcleo, el aumento de la eficiencia SSN unad fidelidad 44. Creciendo hPSCs en MEFs es un método robusto y de bajo costo para mantener hPSCs en un estado pluripotente sin diferenciación excesiva. Además, permite el fácil aislamiento de colonias genéticamente idénticos. Alternativamente, es posible hPSCs de cultivo sin MEFs, sin embargo estas condiciones de cultivo pueden ser más caros que los cultivos basados ​​alimentadoras. Además, todo el proceso es escalable, lo que permite el aislamiento de edición de eventos muy raros o la generación de muchas líneas celulares distintas en experimentos paralelos de edición.

El protocolo descrito aquí es robusto; sin embargo, hay varios pasos clave que afectan a la eficiencia con la que clones editado correctamente se pueden obtener. El componente más crítico para este método es que tiene MEFs de alta calidad y resistentes MEFs DR4 drogas. La supervivencia de hPSCs individuales es tenue, y MEFs baja calidad impedirá el aislamiento de líneas diferenciadas HPSC. En segundo lugar, el uso de Y-27632 es tambiénclave para permitir solo la supervivencia celular sin generar una presión selectiva para las células con un cariotipo anormal 45. En tercer lugar, recogiendo colonias bien espaciadas garantiza homogeneidad genética de las líneas celulares derivadas. Finalmente, es importante preparar pipetas de vidrio de modo que la abertura es lo suficientemente pequeño para romper la colonia en muchos pedazos más pequeños, asegurando que múltiples colonias crecerán en el nuevo pozo. Esto permite la recogida de subclones bien espaciadas para una placa de réplica para tener en la cultura, dejando la placa original de colonias aisladas para el genotipado. Una parte difícil en este protocolo es el manual tirando de las pipetas de vidrio; esta debe ser practicado de antemano. Cabe señalar que existen múltiples técnicas de picking clon que no requieren una pipeta de vidrio. Se anima a los experimentadores para encontrar el que funciona mejor para ellos.

Existen limitaciones a este protocolo que puede ser superado por modificaciones sencillas. Un experimento destinado a oólo perturbar el lugar de interés sin reparación o aquel cuya reparación plantilla no contiene un casete de selección, debe utilizar otro método de enriquecimiento para las células que fueron editadas. Tenga en cuenta que el número de colonias que deben ser recogidos para encontrar un clon positivo aumenta en gran medida en ausencia de selección. Una estrategia para mejorar la eficiencia es para co-transfectar un plásmido no integrador que expresa una proteína fluorescente. Después de permitir que las células se recuperen durante dos días, las células diana pueden ser ordenados en la fluorescencia positiva utilizando fluorescencia de clasificación de células activadas y replated 29. Este proceso enriquece para células que han sido transfectadas con los plásmidos por electroporación y por lo tanto aumenta la probabilidad de un evento de edición concurrente en la célula.

Las técnicas descritas aquí se pueden extender para utilizar varios RNAs guía para orientar de forma simultánea varios 14,46,47 loci. Muchos protocolos se han establecido para diferenciar hPSCsen distintos tipos de células, lo que permite varias manipulaciones genéticas en los tipos de células de interés 30. En general, hemos demostrado el potencial para la edición genoma eficientes en hPSCs independientemente de la elección SSN. Proponemos que esta técnica se puede adaptar para crear líneas isogénicas HPSC que han sido editados-gen en cualquier locus genómico.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por una subvención de Semilla de Fundación de Investigación del Cerebro (BRFSG-2014-02) para Helen Bateup. Dirk Hockemeyer es un nuevo Académico en el envejecimiento de la Fundación Médica Ellison y es apoyado por la Fundación Glenn así como el El Shurl y Fundación Kay Curci. DH también es apoyado por el NIH subvención 1R01CA196884-01.

Materials

DMEM/F12 Life Technologies 11320082
Fetal Bovine Serum (HI) Life Technologies 10082-147
Knockout Serum Life Technologies 10828-028
Fibroblast Growth Factor – basic Life Technologies PHG0261
Pen/Strep Life Technologies 15140-122
Glutamine Life Technologies 25030-081
MEM NEAA Life Technologies 11140-050
2-mercaptoethanol Life Technologies 21985-023
Y-27632 Calbiochem 688000
6-well plates Corning 3506
12-well plates Corning 3512
4mm Electroporation cuvettes Bio-rad 165-2081
X-cel gene pulser II Bio-rad 165-2661
0.25 % Trypsin-EDTA Life Technologies 25200-056
10× Phosphate buffered saline (PBS) pH7.4  Life Technologies 70011-044
Puromycin Life Technologies A11138-02
Pasteur pipettes, plugged VWR 14672-412
Tris-HCl Sigma-Aldrich S5941
NaCL Sigma-Aldrich S9888
SDS Sigma-Aldrich L3771
EDTA Sigma-Aldrich E5134
Proteinase-K Life Technologies AM2544
Ethanol VWR TX89125-172SFU
Isopropyl Alcohol VWR MK303216
TE Buffer Life Technologies 12090-015
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
1.8 ml Cryotubes ThermoScientific 377267
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Carroll, D. Genome engineering with targetable nucleases. Annu Rev Biochem. 83, 409-439 (2014).
  2. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
  3. Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery. Sci Transl Med. 6 (239), 239ps6 (2014).
  4. Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol. 27 (9), 851-857 (2009).
  5. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29 (8), 731-734 (2011).
  6. Bozas, A., Beumer, K. J., Trautman, J. K., Carroll, D. Genetic analysis of zinc-finger nuclease-induced gene targeting in drosophila. Genética. 182 (3), 641-651 (2009).
  7. Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in drosophila using zinc-finger nucleases. Genética. 161 (3), 1169-1175 (2002).
  8. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
  9. DeKelver, R. C., et al. Functional genomics, proteomics, and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome. Genome Res. 20 (8), 1133-1142 (2010).
  10. Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435 (7042), 646-651 (2005).
  11. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  12. Jinek, M., East, A., Cheng, A., Lin, S., Ma, E., Doudna, J. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, e00471 (2013).
  13. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. the new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
  14. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  15. Jasin, M. Genetic manipulation of genomes with rare-cutting endonucleases. Trends Genet. 12 (6), 224-228 (1996).
  16. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).
  17. Sander, J. D., Maeder, M. L., Reyon, D., Voytas, D. F., Joung, J. K., Dobbs, D. ZiFiT (zinc finger targeter): An updated zinc finger engineering tool. Nucleic Acids Res. 38, W462-W468 (2010).
  18. Carroll, D., Morton, J. J., Beumer, K. J., Segal, D. J. Design, construction and in vitro testing of zinc finger nucleases. Nat Protoc. 1 (3), 1329-1341 (2006).
  19. Chen, F., et al. High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases. Nat Methods. 8 (9), 753-755 (2011).
  20. Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (12), e82 (2011).
  21. Reyon, D., Tsai, S. Q., Khayter, C., Foden, J. A., Sander, J. D., Joung, J. K. FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing. Nat Biotechnol. 30 (5), 460-465 (2012).
  22. Sanjana, N. E., Cong, L., Zhou, Y., Cunniff, M. M., Feng, G., Zhang, F. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nat Protoc. 7 (1), 171-192 (2012).
  23. Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from neisseria meningitidis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (39), 15644-15649 (2013).
  24. Podhajska, A. J., Szybalski, W. Conversion of the FokI endonuclease to a universal restriction enzyme: Cleavage of phage M13mp7 DNA at predetermined sites. Gene. 40 (2-3), 175-182 (1985).
  25. Costa, M., et al. A method for genetic modification of human embryonic stem cells using electroporation. Nat Protoc. 2 (4), 792-796 (2007).
  26. Chambers, S. M., Fasano, C. A., Papapetrou, E. P., Tomishima, M., Sadelain, M., Studer, L. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
  27. Cai, J., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).
  28. Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest. 108 (3), 407-414 (2001).
  29. Soldner, F., et al. Parkinson’s disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors. Cell. 136 (5), 964-977 (2009).
  30. Wen, Z., et al. Synaptic dysregulation in a human iPS cell model of mental disorders. Nature. 515 (7527), 414-418 (2014).
  31. Chiba, K., Hockemeyer, D. Genome editing in human pluripotent stem cells using site-specific nucleases. Methods Mol Biol. 1239, 267-280 (2015).
  32. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
  33. Ezashi, T., Das, P., Roberts, R. M. Low O2 tensions and the prevention of differentiation of hES cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (13), 4783-4788 (2005).
  34. Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes. Nucleic Acids Res. 25 (18), 3745-3746 (1997).
  35. Southern, E. Southern blotting. Nat Protoc. 1 (2), 518-525 (2006).
  36. Henegariu, O., Heerema, N. A., Dlouhy, S. R., Vance, G. H., Vogt, P. H. Multiplex PCR: Critical parameters and step-by-step protocol. BioTechniques. 23 (3), 504-511 (1997).
  37. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  38. Sexton, A. N., et al. Genetic and molecular identification of three human TPP1 functions in telomerase action: Recruitment, activation, and homeostasis set point regulation. Genes Dev. 28 (17), 1885-1899 (2014).
  39. Merkle, F. T., et al. Efficient CRISPR-Cas9-mediated generation of knockin human pluripotent stem cells lacking undesired mutations at the targeted locus. Cell Rep. 11 (6), 875-883 (2015).
  40. Soldner, F., et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset parkinson point mutations. Cell. 146 (2), 318-331 (2011).
  41. Forster, R., et al. Human intestinal tissue with adult stem cell properties derived from pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2 (6), 838-852 (2014).
  42. Miller, J. C., et al. Improved specificity of TALE-based genome editing using an expanded RVD repertoire. Nat Methods. , (2015).
  43. Hohenstein, K. A., Pyle, A. D., Chern, J. Y., Lock, L. F., Donovan, P. J. Nucleofection mediates high-efficiency stable gene knockdown and transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 26 (6), 1436-1443 (2008).
  44. Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
  45. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
  46. Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system. Sci Rep. 4, 5400 (2014).
  47. Ousterout, D. G., Kabadi, A. M., Thakore, P. I., Majoros, W. H., Reddy, T. E., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 6, 6244 (2015).

Tags

Genome EditingHuman Pluripotent Stem CellsDisease ModelingColony IsolationTargetingTransfectionCRISPRZinc Finger NucleaseTALONFeeder CellsTrypsinizationCell Culture

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Blair, J. D., Bateup, H. S., Hockemeyer, D. F. Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation. J. Vis. Exp. (108), e53583, doi:10.3791/53583 (2016).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image