Summary

في المختبر جيل من الخلايا الجذعية من الفئران بلازماوية الشكل المشتركة اللمفاوية الأسلاف باستخدام نظام تغذية AC-6

Published: November 23, 2015
doi:

Summary

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

Abstract

الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل (pDCs) هي نوع قوي I إنترفيرون (IFN-I) المنتجة للخلايا التي يتم تفعيلها في الاستجابة للعدوى أو أثناء الاستجابات الالتهابية. للأسف، إن ما يعرقل دراسة وظيفة PDC بواسطة التردد المنخفض في الأجهزة اللمفاوية، والأساليب القائمة لفي المختبر الجيل DC يفضلون في الغالب إنتاج جان تنمية المجتمعات المحلية على pDCs. هنا نقدم نهجا فريدا لتوليد بكفاءة pDCs من الأسلاف اللمفاوية المشتركة (CLPs) في المختبر. على وجه التحديد، وصفت البروتوكول تفاصيل كيفية تنقية CLPs من نخاع العظام وتوليد pDCs التي كتبها coculturing مع AC-6 الخلايا المغذية-المشع γ في وجود Flt3 يجند. ومن الخصائص الفريدة لهذا النظام الثقافة هي أن CLPs تهاجر تحت الخلايا AC-6 وتصبح الخلايا المكونة للمنطقة حصوه، خطوة حاسمة لتوسيع pDCs. تم إنشاء البلدان النامية متميزة شكليا، وهي pDCs وجان تنمية المجتمعات المحلية، وبعد ما يقرب من 2 أسابيع مع تكوين 70-90٪ pDCs تحت الظروف المثلى. عادة، وعدد من pDCs التي تم إنشاؤها بواسطة هذا الأسلوب هو ما يقرب من 100 أضعاف عدد CLPs المصنفة. لذلك، هذا هو نظام الرواية التي لتوليد بقوة الأعداد الكبيرة من pDCs اللازمة لتسهيل إجراء المزيد من الدراسات في تطوير وظيفة هذه الخلايا.

Introduction

الخلايا الجذعية (DCS) هي خلايا العارضة للمستضد المهنية التي تلعب دورا هاما في السيطرة على الاستجابات المناعية 1. بينما البلدان النامية غير متجانسة، فإنها يمكن تصنيفها إلى قسمين السكان، البلدان النامية التقليدي (جان تنمية المجتمعات المحلية) والبلدان النامية بلازماوية الشكل (pDCs) 2،3. بالإضافة إلى الأجهزة اللمفاوية، تم العثور جان تنمية المجتمعات المحلية وpDCs أيضا في الأنسجة بما في ذلك الرئة والأمعاء، والجلد 2. مورفولوجية جان تنمية المجتمعات المحلية وpDCs يختلف، مع جان تنمية المجتمعات المحلية واظهار التوقعات تشبه التغصنات وشكل pDCs يجري مثل خلية المزيد من البلازما. بالإضافة إلى ذلك، الماوس المشترك DC علامة، CD11c و، وأعرب أكثر إلى حد كبير على جان تنمية المجتمعات المحلية من على pDCs. وعلاوة على ذلك، جان تنمية المجتمعات المحلية ويمكن تقسيمها الى مزيد من CD11b + CD24 جان تنمية المجتمعات المحلية وCD11b CD24 + جان تنمية المجتمعات المحلية، وكلاهما تعبير عن مستويات أعلى من الدرجة MHC II والجزيئات costimulatory من القيام pDCs 2. pDCs ناضجة، من ناحية أخرى، وقد ثبت للتعبير بشكل انتقائي Siglec-H وBST2 4. Functionally، جان تنمية المجتمعات المحلية والمستضد أفضل عرض الخلايا من هم pDCs. ومع ذلك، يمكن pDCs تنتج كمية هائلة من النوع الأول إنترفيرون على عدوى فيروس أو التحفيز التهابات 5.

كلا جان تنمية المجتمعات المحلية وpDCs وقصيرة الأمد، وبالتالي، يجب أن تتجدد باستمرار من الأسلاف في نخاع العظم (BM) 6،7. نقل بالتبني من الأسلاف المشتركة الدم النخاعي (CMPS) والأسلاف اللمفاوية المشتركة (CLPs) في الفئران قاتل المشع يوضح أن جان تنمية المجتمعات المحلية وpDCs يمكن أن تتولد من كل الأنساب 10/08. ومع ذلك، هناك مجموعة فرعية من pDCs التي تعبر عن RAG1 / 2 وتمتلك قطاعات DJ ترتيبها في موضع IGH 11،12. كما شارك هذه الخلايا الجزيئية التشابه مع الخلايا الليمفاوية B، بما في ذلك التعبير عن علامة B220، الاستشعار الحمض النووي مستقبلات (TLR7 / TLR9)، وعوامل النسخ (Spib وBcl11a) 13، ويضم كل يعتقد أن التوقيعات على النسب اللمفاوية. ولذلك، CLPالصورة قد تكون خيارات جيدة للجيل في المختبر من pDCs بسبب النسب التشابه.

في حين أن تردد كل من جان تنمية المجتمعات المحلية وpDCs في البشر والفئران منخفض جدا البلدان النامية، ولا سيما جان تنمية المجتمعات المحلية، يمكن أن تتولد في المختبر من BM أو الأسلاف في حضور السيتوكينات، مثل GM-CSF 11،14 أو Flt3 يجند (FL ) باستخدام أنظمة خالية المغذية 11،15،16. لسوء الحظ، ومع ذلك، فإنه ليس من الممكن لإنتاج أعداد كبيرة من pDCs في المختبر باستخدام FL 11،15،16. سابقا أثبتنا أن pDCs يمكن أن تتولد بكفاءة في المختبر من CLPs باستخدام نظام AC-6 التغذية 17. وميزة استخدام خط الخلية انسجة AC-6 في نظام الثقافة هو أنه يوفر اتصال خلية خلية وإفراز السيتوكينات التي تدعم توليد أعداد كبيرة من pDCs من CLPs. على الرغم من أن الإنتاج مع هذا النظام قوي جدا، والنسخ دقيق للإجراءات المبينة أدناه مطلوب طالدرجة n لضمان جيل كفاءة pDCs.

Protocol

تم شراؤها C57BL / 6 الفئران البرية من نوع من المركز الوطني للمختبر الحيوان (NLAC)، تايوان. كانت ولدت كل الفئران وأبقى في ظروف خالية من مسببات الأمراض المحددة. تم استعراض البروتوكولات والإجراءات استخدام الحيواني والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من كلية جامعة…

Representative Results

وعادة ما يتم عزل ما مجموعه 4-6×10 7 خلايا BM من عظام الفخذ والظنبوب واحدة 6-8 أسبوع عمره، من النوع البري C57BL / 6 الماوس. لفرز CLPs، هي ملطخة مجموع الخلايا BM مع الأجسام المضادة PE مترافق ضد علامات النسب (CD3، CD8، B220، CD19، CD11b، GR-1، Thy1.1، NK1.1، TER119، وMHC-II)، ومكافحة -c-كيت-PerCP / Cy5.5، ومكاف?…

Discussion

نحن هنا وصف في المختبر نظام الثقافة للجيل قوي من البلدان النامية، وpDCs على وجه الخصوص، من عدد صغير من CLPs. ويرجع ذلك إلى استخدام AC-6 خلايا، خط خلية اللحمية، كما مغذيات تفرد هذا النظام الثقافة. وقد تبين هذا النهج لتوفير ليس فقط السيتوكينات، مثل IL-7، SCF، M-CSF وFL 20، ?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونحن ممتنون لالدكاترة. ماركوس مانز وايرفينغ ويسمان لتوفير الكواشف. نحن نعترف أيضا الخدمات التي يقدمها تدفق Cytometric تحليل والخلية مرفق الفرز الأساسية من الأول ومختبر الأساسية الثانية في كلية جامعة تايوان الوطنية مستشفى الطب وجامعة تايوان الوطنية، على التوالي. وأيد هذا العمل من قبل وزارة العلوم والتكنولوجيا، تايوان (MOST 102-2320-B-002-030-MY3) والمعاهد الوطنية للبحوث الصحية، تايوان (المؤسسة الوطنية-EX102-10256SI وطنية لحقوق الإنسان-EX103-10256SI).

Materials

Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5 Biolegend 108408 linage marker
Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136 Biolegend 108708 linage marker
Anti-mouse  CD11b (PE), cloneM1/70 Biolegend 101208 linage marker
Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3 Biolegend 115508 linage marker
Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2 Biolegend 103208 linage marker/FACS
Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2 Biolegend 100308 linage marker
Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7 Biolegend 100707 linage marker
Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4 Biolegend 107608 linage marker
Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119 Biolegend 116208 linage marker
Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51 eBioscience 12-0900-83 linage marker
Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98 Biolegend 135510 FACS
Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8 Biolegend 105824 FACS
Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7 Biolegend 108106 FACS
Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34 Biolegend 135014 FACS
Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418 Biolegend 117328 FACS
Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70 Biolegend 101206 FACS
FACSAria III BD Biosciences Cell sorter
FACS sorting tube  BD Biosciences 352054
FlowJo FlowJo LLC Flow analysis sofrware

Referências

  1. Hartwig, C., et al. Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation. Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).
  2. Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annu. Rev. Immunol. 31, 563-604 (2013).
  3. Mildner, A., Jung, S. Development and Function of Dendritic Cell Subsets. Immunity. 40, 642-656 (2014).
  4. Swiecki, M., Colonna, M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunol. Rev. 234, 142-162 (2010).
  5. Liu, Y. J. IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annu. Rev. Immunol. 23, 275-306 (2005).
  6. Merad, M., Manz, M. G. Dendritic cell homeostasis. Blood. 113, 3418-3427 (2009).
  7. Ghosh, H. S., Cisse, B., Bunin, A., Lewis, K. L., Reizis, B. Continuous expression of the transcription factor e2-2 maintains the cell fate of mature plasmacytoid dendritic cells. Immunity. 33, 905-916 (2010).
  8. Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J. Exp. Med. 198, 305-313 (2003).
  9. Manz, M. G., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L., Akashi, K. Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors. Blood. 97, 3333-3341 (2001).
  10. D’Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198, 293-303 (2003).
  11. Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121, 11-19 (2013).
  12. Shigematsu, H., et al. Plasmacytoid dendritic cells activate lymphoid-specific genetic programs irrespective of their cellular origin. Immunity. 21, 43-53 (2004).
  13. Reizis, B., Bunin, A., Ghosh, H. S., Lewis, K. L., Sisirak, V. Plasmacytoid dendritic cells: recent progress and open questions. Annu. Rev. Immunol. 29, 163-183 (2011).
  14. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J. Exp. Med. 176, 1693-1702 (1992).
  15. Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. Nat. Immunol. 8, 1217-1226 (2007).
  16. Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8, 1207-1216 (2007).
  17. Chen, Y. L., et al. A type I IFN-Flt3 ligand axis augments plasmacytoid dendritic cell development from common lymphoid progenitors. J. Exp. Med. 210, 2515-2522 (2013).
  18. Whitlock, C. A., Tidmarsh, G. F., Muller-Sieburg, C., Weissman, I. L. Bone marrow stromal cell lines with lymphopoietic activity express high levels of a pre-B neoplasia-associated molecule. Cell. 48, 1009-1021 (1987).
  19. Onai, N., Obata-Onai, A., Tussiwand, R., Lanzavecchia, A., Manz, M. G. Activation of the Flt3 signal transduction cascade rescues and enhances type I interferon-producing and dendritic cell development. J. Exp. Med. 203, 227-238 (2006).
  20. Szilvassy, S. J., et al. Leukemia inhibitory factor upregulates cytokine expression by a murine stromal cell line enabling the maintenance of highly enriched competitive repopulating stem cells. Blood. 87, 4618-4628 (1996).
  21. Arcanjo, K., et al. Biochemical characterization of heparan sulfate derived from murine hemopoietic stromal cell lines: a bone marrow-derived cell line S17 and a fetal liver-derived cell line AFT024. J. Cell. Biochem. 87, 160-172 (2002).
  22. Onai, N., et al. A clonogenic progenitor with prominent plasmacytoid dendritic cell developmental potential. Immunity. 38, 943-957 (2013).
  23. Whitlock, C. A., Muller-Sieburg, C. E. Long-term B-lymphoid cultures from murine bone marrow establishment and cloning by using stromal cell line AC 6.21. Methods Mol. Biol. 75, 231-248 (1997).
  24. Chen, Y. -. L., Chang, S., Chen, T. -. T., Lee, C. -. K. Efficient Generation of Plasmacytoid Dendritic Cell from Common Lymphoid Progenitors by Flt3 Ligand. PLoS ONE. 10 (8), e0135217 (2015).

Play Video

Citar este artigo
Chang, S., Pai, L., Lee, C. In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System. J. Vis. Exp. (105), e53211, doi:10.3791/53211 (2015).

View Video