単一細胞分泌物の時空間イメージング用ラベルフリー技術

1.ナノ構造作製ナノファブリケーションのための基質として170ミクロン（1.5号）のおおよその厚さと直径25mmのカバーガラスを選択してください。 少なくとも6時間（硫酸と過酸化水素水の比1 3）ピラニア溶液中でカバースリップを浸します。超純18.2MΩ脱イオン蒸留水（DDW）のおびただしい量のピラニア浸したカバースリップを洗ってください。 注意：ピラニア酸は、有機物質と激しく反応し、細心の注意を払って取り扱わなければなりません。 ナノ構造のパターニングおよび撮像中電荷効果を回避するために、電子ビーム蒸着法によりカバーガラス上に堆積10nmのクロム薄膜。 二重層の第1層が45秒間2000rpmで乳酸エチルメチルメタクリレート（MMA_EL6）共重合体からなるレジストをスピンし、次いで150℃で焼きます。その後、180℃で焼く45秒間3000rpmでポリメチルメタクリレート（950PMMA_A2）の第二の層をスピン。 パターN二重層300μC/ cm 2の面積線量で25キロボルトの電子ビームリソグラフィ（EBL）を用いたレジスト。イソプロピルアルコール（IPA）/メチルイソブチルケトン（MIBK）で開発：2/1およびIPAですすぎます。 電子ビーム蒸発器を用いて基板上に堆積したTi（5 nm）の/金（80 nm）のフィルム。 金の堆積に続いて、共重合体の二重層が4時間アセトンに基板を浸漬することにより、レジストのリフトオフ。 ナノ構造の形状及び大きさを確認するために、走査型電子顕微鏡（SEM）を用いて基板を検査し、RTで60秒間CR-7のエッチャントを用いたウェットエッチングによって基板から残りのクロムを除去した後、DDWですすぎます。 アレイ間の細胞イメージングのための余地を残すために33ミクロンの中心の配列間隔を​​設計します。電子ビーム描画装置を用いて、300nmのピッチで配列ごとに20×20のパターンでパターンナノ構造を。各チップは、80±2.5 nmの高さと70±2.5 nmでディアメの典型的なナノ構造寸法の300の配列が含まれていますター。 大きさや均一性を検証するための原子間力顕微鏡（AFM）を用いて、配列のサブセットを検査します。 UV硬化性エポキシを使用して、カバーガラスの背面に、サポートリング、典型的にはシリコンを取り付けます。 2.チップクリーニングと自己組織化単分子膜への応用洗浄のため、同一条件下で5分間、チャンバをクリーニングした後、チップ、5％水素の300ミリトール混合物中の40 Wの電力でプラズマアッシュ、45秒間95％のアルゴンを再生します。 1 SH-の比率（CH 2）8 -EG 3 -OH（SPO）およびアミンのいずれかを有する成分：3からなる二成分エタノールチオール溶液にチップを浸漬することにより直ちにプラズマアッシング後の金ナノ構造を官能またはカルボキシル官能基、すなわち、SH-（CH 2）11 -EG 3 -NH 2（SPN）またはSH-（CH 2）11 -EG 3 -COOH（SPC）。 チップIを残しますn個のチオール溶液をO / N自己組織化単分子膜（SAM）を形成します。 窒素ガスをエタノールとドライでチップを洗浄します。 必要に応じて、4℃で2週間まで官能チップを格納します。 使用可能な状態には、選択したリガンドに応じて化学反応を用いて、リガンドとSPNまたはSPCのコンポーネントを反応させた場合（下記参照）。 注意：チップは何十回も再生され、再官能化することができます。指定されたチップは、6ヶ月から一年間に及ぶ期間のために使用することができます。指定された配列で測定スペクトルは、確実に生体機能化に続いて、プラズマアッシングにより、繰り返し再生の後に再生されます。29 3.表面機能とキネティック特性評価注：リガンドとアナライトとの間の動力学的速度定数を特徴付けるために、ならびに非特異的BにSAMの耐性を研究するために商業SPR機器で官能化チップを使用してinding。流量と効率的な表面機能を可能にするマイクロ流体設計の広い範囲があります。我々は、市販のSPRを持っているので、私たちはその推奨流量を中心に標準化しました。我々は、これらの流量はすべてのSPR機器の典型的なものであるので、制限するものではないことに注意してください。すべての機能化がLSPRチップ上で直接行うことができますが、それは多重化機器があるため、私たちのLSPRマイクロ流体セットアップがないのに対し、それが私たちの作業負荷を軽減なかったため、SPR機器は必要ありません。 第2節で説明したように、SAMを有する市販の裸の金チップを官能。 10 1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC）の133 mmでDDW 中のNヒドロキシスクシンイミドの33 mMの（NHS）の1：1混合物、SPCベースのSAMを使用して、1とカルボキシル基を活性化する場合分。 30μl/分の流速を使用して300秒間、目的の抗体/リガンドで活性化したカルボキシル基を結合。リガンドを準備中pH6のリン酸緩衝液は、典型的には、これは、分子に依存して変化し得ます。 リガンドコンジュゲーションの後、30μL/分の速度で300秒間の不活性化工程として、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の0.1 Mエタノールアミンを流します。エタノールアミンは、非特異的結合を最小限に抑えるのに役立ちます。 濃度の範囲を使用して、100μL/分の流速で、目的の分析物を導入し、反応速度分析ソフトウェアを用いて反応速度定数を算出します。 非特異的結合に問題がある場合は、SPCまたはSPNにSPOの割合を増加させます。 4. LSPR一般設定顕微鏡の設定： サンプルを照らすケーラーに、100Wハロゲンランプを使用してください。共鳴シフト（ 図2）に寄与しない波長を除去するために光路にロングパスフィルタ（通常は593 nmのカットオフ）を使用します。 LSPRiデータ収集のために、40X油immersioで倒立顕微鏡を使用n個の対物レンズ（1.4 NA）と熱電は、16ビットのCCDカメラを冷却しました。 同時に画像とスペクトルを得るために、顕微鏡の出力ポートにビームスプリッタを配置します。 37に温度制御された顕微鏡ステージを設定します。 Cを°と4時間平衡化。 それぞれ、5％および95％のCO 2濃度及び湿度を調節するために顕微鏡に追加の培養アセンブリを組み込みます。 チップの準備と取り付け： SPR実験から決定された最適二成分のSAM比の第2節で説明したようにLSPRチップを官能。 次のようにカスタムメイドのマイクロ流体ホルダー内のチップをロードします。アルミボトムピースにチップを置きます。この底部片とシリコーンガスケットと透明なプラスチックトップピースとの間のチップを挟みます。アセンブリをクランプする4本のネジを使用してください。 1ミックス：典型的なSPCベースチオールアプリケーションでは、1μLのコート300をドロップSPCチオール成分のカルボキシル基を活性化するために、EDCの133ミリ、DDWでNHSの33 mMとチャー。 10分間待ってから、手動で10mMのPBSで表面を洗い流してください。 リガンド溶液を300μlをコーティング降下によって、目的のリガンド（典型的には、抗体または抗体断片）で活性化されたカルボキシル基をコンジュゲート。 30分間待ってから、手動で10mMのPBSですすいでください。 非特異的結合を最小限に抑えるために、チップ上のコートを、PBS中の0.1Mエタノールアミンの300μLをドロップします。 10分間待ちます。 PBSは、0.005％トゥイーン20（PBS-T20）を含有するエタノールを洗ってください。 更衣メニスカスに関連するデータの変動を低減するために、チップの上に水晶片を置きます。 顕微鏡に取り付けながら、PBS-T20緩衝液で濡れたチップを保管してください。 加熱されたステージの試料ホルダーにしっかりとLSPRチップアセンブリを配置し、マイクロ流体チューブを取り付けます。 アセンブリにマイクロ流体チューブを取り付け、府の流れffer（または細胞研究のための無血清培地）定常状態に達するまで。 アセンブリおよび顕微鏡は、少なくとも2時間平衡化することを許可します。 中央アレイは分光用光ファイバと整列するように、ジョイスティックを使用して、チップの位置を合わせます。分光分析データは、分光計およびスペクトル解析ソフトウェアを用いて行われます。 ソフトウェアオートフォーカス、ツァイス明確なフォーカスまたは同等のオートフォーカス装置を用いて、実験を通じて、焦点の配列をしてください。 9E10ハイブリドーマ細胞から抗c-mycの分泌物の5 LSPRイメージング注：この研究のために使用されるハイブリドーマ細胞株は、化学的トリガーを必要とせず、構成、従って抗c-myc抗体を発現します C-mycのペプチドでナノ構造体を官能。これは、クローン9E10ハイブリドーマ細胞によって分泌された抗c-mycの抗体について1.77 nMでのK D値を有します 。 complet文化ハイブリドーマ細胞5％CO 2下、37℃でT75フラスコ中、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％抗生物質を含む電子成長培地。 4×10 5細胞/ mlの細胞密度を維持します。 細胞分泌の研究のために、遠心分離によってT75フラスコからのペレット細胞は、分泌された抗体を除去し、4×10 6細胞/ mlの細胞密度を調整するためにRPMI-1640無血清培地（SFM）で2回洗浄します。 LSPRチップにそれらを導入する前に、生存のために、細胞およびテストを収穫。 手動マイクロピペットでLSPRチップ上に細胞溶液50μlをご紹介します。数分後に25〜50の細胞は、LSPRチップの表面に付着します。 マイクロ流体灌流システムを用いて、新鮮なSFMに溶液中に残った細胞を洗い流します。 10ミクロンの範囲内、接近しているイメージングのためのLSPRアレイを選択しますが、セルと重なっていません。 信号が分泌抗c-mycのantibに特異的であることを確実にするために、odiesは、抗体を用いたが、溶液中でのc-mycのペプチドの飽和濃度の存在によって遮断され、それらの結合部位を有する本だけでなく、抗体を用いてとせず、細胞培養培地をご紹介します。 抗c-mycの抗体（250 nM）を、飽和溶液を用いて各実行の最後にセンサーを調整します。これは、センサの応答を正規化するのに役立ちますし、各ランの生体機能化プロファイルに基づいて部分占有を決定します。 画像アラインメントソフトウェアを使用して、XとY方向のドリフトを修正してください。