المنهج الوراثي إلى الأمام للكشف عن الإجهاد الجينات المقاومة في الفئران - شاشة عالية الإنتاجية في خلايا ES
Summary
مقاومة الإجهاد هي واحدة من السمات المميزة لطول العمر وكما هو معروف أن تحكم وراثيا. هنا، قمنا بتطوير أسلوب الإنتاجية العالية متحيز للكشف عن الطفرات التي تمنح مقاومة الإجهاد في خلايا ES التي لتطوير نماذج الماوس للدراسات طول العمر.
Abstract
Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely limits its potential. We describe here the use of mouse embryonic stem (ES) cells as surrogate cells to screen for a phenotype of interest and subsequently introduce these cells into a host embryo to develop into a living mouse carrying the phenotype. This method provides (1) a cost effective, high-throughput platform for genetic screen in mammalian cells; (2) a rapid way to identify the mutated genes and verify causality; and (3) a short-cut to develop mouse mutants directly from these selected ES cells for whole animal studies. We demonstrated the use of paraquat (PQ) to select resistant mutants and identify mutations that confer oxidative stress resistance. Other stressors or cytotoxic compounds may also be used to screen for resistant mutants to uncover novel genetic determinants of a variety of cellular stress resistance.
Introduction
طول العمر له علاقة حميمة مع مقاومة الإجهاد. بشكل عام، والأنواع المعمرة في كثير من الأحيان تبرهن زيادة مقاومة تجاه الضغوطات متعددة، مثل بيروكسيد الهيدروجين، الباراكوات (PQ) والأشعة فوق البنفسجية والحرارة والمعادن الثقيلة 1،2. في المقابل، زيادة الحساسية للإجهاد تميل إلى التنبؤ تقصير العمر الافتراضي و / أو عرضة للأمراض النمط الظاهري أكثر من ذلك. منذ فترة طويلة وتكهن مسح مسار مضادة للأكسدة للعب دورا رئيسيا في منح مقاومة الإجهاد للحيوان. ومع ذلك، مع استثناءات قليلة، دراسات من مجموعة متنوعة من الحيوانات المعدلة وراثيا مع التلاعب في مختلف الانزيمات المضادة للأكسدة (على سبيل المثال، SOD) تشير إلى أن زيادة مستوى أكسدة الانزيمات الكسح لا يزيد عمر أو فترة الصحية 3. وتشير هذه البيانات إلى أن مقاومة الإجهاد سمة احظ باستمرار في الحيوانات طويلة العمر بوساطة مسارات الخلوية الأخرى لم يتم الكشف عنها.
وقد اتخذنا الأمام متحيزنهج الجيني لتحديد الجينات التي عليها تحور، يمكن أن يضفي على النمط الظاهري المقاومة التوتر في الجذعية الجنينية مثقف (ES) الخلايا. خلايا ES تقدم اثنين من المزايا الرئيسية في هذه الدراسة: (1) هي التلاعب الجيني متطورة المتاحة لتعديل جينوم خلايا ES. و (2) أي خلايا ES مقاومة الإجهاد تعافى من الشاشة يمكن استخدامها مباشرة لإنتاج الماوس، مما يسمح للترجمة السريعة في الدراسات الحيوانية كلها لقياس مدى الحياة، ومدى صحة.
في هذا التقرير، وصفنا استخدام خط الخلية C9 ES، التي كانت الأليلات بلم تحت سيطرة عنصر استجابة التتراسيكلين. علاج الدوكسيسيكلين (دوكس) تحول عابر من التعبير عن بلم مما يؤدي إلى زيادة حادث تبادل chromatid الشقيقة. هذا على المدى القصير بلم خروج المغلوب يسمح لتوليد طفرات متماثل بين السكان متغايرة بحيث يمكن أن يتم القبض الطفرات المتنحية لمقاومة الإجهاد في عملية الفرز. نحنكما وصفت استخدام piggyBac (PB) ينقول كما المغير لادخال عشوائيا بولي-A فخ كاسيت (PB-UPA) على التحور الجينات في الجينوم. أصبحت الخلايا مع اختلال الجينات التي بولي-A فخ G418 مقاومة ويمكن استردادها بحيث يمكن تقديم مجموعة من الجينات فخ المسوخ (مكتبة الجينات شرك)، وفحص في وقت لاحق لاستنساخ متحولة التي كانت مقاومة الإجهاد.
يمكن وصف استنساخ مقاومة الإجهاد تعافى من الاختيار بدلا بسرعة عن طريق التقنيات الجزيئية في الشأن عدد من الملاحق (QPCR)، موقع الإدراج (splinkerette PCR)، وهوية الجينات تعطلت (انفجار)، ومستوى التعبير ( RT-QPCR). يمكن remobilized الإدراج PB التي كتبها التعبير عابر MPB transposase في استنساخ لاستعادة تسلسل الحمض النووي من النوع البري، وبالتالي اختبار لفقدان مقاومة الإجهاد. هذه هي وسائل قوية لتأكيد العلاقة السببية من الطفرة التي ينبغي القيام به قبلإلى إنتاج الماوس مكلفة. وأظهرت دراسات سابقة أن الخلايا تتعرض لضغوطات فقدت 4،5 تعدد القدرات الخاصة بهم. وهكذا، في هذا البروتوكول، والحفاظ على نسخة طبق الأصل مجموعة من خلايا متحولة، والتي لن يتم التعامل مع الضغوطات أمر بالغ الأهمية لإنتاج الماوس ناجحة.
لدينا مختبر تمت هندستها خط الخلية C9 ES وناقلات PB-UPA، وكلاهما متاح للمحققين آخرين بناء على طلبها. سوف بروتوكول ذكرت هنا يبدأ من جيل دي نوفو مكتبة خلايا المحاصرين الجينات ES مع PB-UPA (الشكل 1A)، تليها الطلاء الاصل واختيار الضغط لعزل الحيوانات المستنسخة مقاومة الإجهاد (الشكل 1B). أثبتنا التحديد مع الباراكوات، مولد الجذور الحرة قوية داخل الخلايا. عمليا، أي مجمع السامة للخلايا أو السم، على سبيل المثال، الضغوطات ER (على سبيل المثال، thapsigargin وtunicamycin)، أكسدة الخلايا العصبية (على سبيل المثال، MPP +، الدوبامين 6-هيدروكسي، وروتينون)، والحرارة، والثقيلةالمعادن (مثل الكادميوم، جنوب شرق)، ويمكن أن تتكيف مع أسلوب لتحديد لطفرات مقاومة منها.
Protocol
Representative Results
Discussion
Forward genetic analysis allows for an unbiased interrogation of the genome for genes responsible for a specific phenotype. This method is very powerful to uncover novel gene functions. It has been widely used in lower organisms but not in mammal, such as the mouse, mainly due to the extremely high cost associated with the infrastructure and logistics that would entail. Here, we moved the genetic screening process to the ES cell culture platform, greatly increasing the efficiency and throughput in generating mutants a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank the Wellcome Trust Sanger Institute for the gifts of piggyBac transposon and piggyBac transposase. This work was supported by the Butcher grant of Colorado and the NIH R01 AG041801 (W.S.C).
Materials
| Vector | ||
| PB-UPA | ||
| mPBase | ||
| mPBasePuro | ||
| Tissue Culture | ||
| 500-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU05RE |
| 250-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU02RE |
| 50-ml Steriflip-GV filters | EMD Millipore | SE1M179M6 |
| KO DMEM | Life Technologies | 10829-018 |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 |
| FBS | Tissue Culture Biologicals | 104 |
| Heat Inactivated FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500 |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 |
| Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140148 |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 |
| Methyl Viologen dichloride (Paraquat) | Sigma-Aldrich | 856177 |
| Dimethyl Sulphoxide Hybri-MAX | Sigma-Aldrich | D2650 |
| EmbryoMAX 0.1% gelatin | EMD Millipore | ES006B |
| DPBS/Modified | HyClone | SH30028.02 |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 |
| T25 Flask | Corning | 353108 |
| T75 flask | Corning | 353135 |
| 100-mm plate | Corning | 353003 |
| 150-mm plate | Corning | 430599 |
| 96-well plate | Corning | 3585 |
| 96-well U-bottom plate | Corning | 3799 |
| 24-well plate | Corning | 3526 |
| 50-ml reservoir | Corning | 4870 |
| 15-ml tubes | VWR International, LLC | 82050-276 |
| Primary Mouse Embryonic Fibroblasts | EMD Millipore | PMEF-NL |
| DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts | Applied StemCell | ASF-1001 |
| Mitomycin C | Fisher BioReagents | BP25312 |
| Geneticin (G418) | Life Technologies | 11811-023 |
| Doxycycline | Fisher BioReagents | BP26531 |
| Cryotubes | Thermo Scientific | 377267 |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 |
| TC10 cell counter | Bio-Rad | |
| Counting Slides (for TC10) | Bio-Rad | 1450011 |
| Electroporation | ||
| Gene Pulser Xcell | Bio-Rad | 1652611 |
| Gene Pulser Cuvettes (4 mm gap) | Bio-Rad | 1652088 |
| Biologia Molecular | ||
| Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercylcer ep Gradient S |
| Puregene Core kit B | Qiagen | 158745 |
| Topo-TA Cloning kit | Life Technologies | 450030 |
| High Capacity cDNA synthesis kit | Applied Biosystems | 4368814 |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 |
| 100% ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2716 |
| Double Processed Tissue Culture Water | Sigma-Aldrich | W3500 |
| Sau3A1 | New England BioLabs | R0169L |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202T |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S |
| 96-well Lysis Buffer (Ramires-Solis et al. 1992) | ||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
| Hydrochloric Acid | Fisher BioReagents | A144-212 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L5777 |
| Proteinase-K | Fisher BioReagents | BP1700 |
| Electrophoresis | ||
| Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad | 170-4469EDU |
| LE Agarose | GeneMate | E3120500 |
| Ethidium Bromide | Fisher BioReagents | BP1302 |
| 100 BP DNA Ladder | New England BioLabs | N3231S |
| 1Kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S |
| 2-log DNA Ladder | New England BioLabs | N3200L |
Referências
- Johnson, T. E., et al. Longevity genes in the nematode Caenorhabditis elegans also mediate increased resistance to stress and prevent disease. J Inherit Metab Dis. 25, 197-206 (2002).
- Murakami, S., Salmon, A., Miller, R. A. Multiplex stress resistance in cells from long-lived dwarf mice. Faseb J. 17, 1565-1566 (2003).
- Perez, V. I., et al. The overexpression of major antioxidant enzymes does not extend the lifespan of mice. Aging Cell. 8, 73-75 (2009).
- Martin, G. M. Genetic engineering of mice to test the oxidative damage theory of aging. Ann NY Acad Sci. 1055, 26-34 (2005).
- Chick, W. S., Drechsel, D. A., Hammond, W., Patel, M., Johnson, T. E. Transmission of mutant phenotypes from ES cells to adult mice. Mamm Genome. 20, 734-740 (2009).
- Ramirez-Solis, R., et al. Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples. Anal Biochem. 201, 331-335 (1992).
- Uren, A. G., et al. A high-throughput splinkerette-PCR method for the isolation and sequencing of retroviral insertion sites. Nat Protoc. 4, 789-798 (2009).
- Wang, W., Bradley, A., Huang, Y. A piggyBac transposon-based genome-wide library of insertionally mutated Blm-deficient murine ES cells. Genome Res. 19, 667-673 (2009).
- Chick, W. S., et al. Screening for stress-resistance mutations in the mouse. Front Genet. 5, 310 (2014).
- Salmon, A. B., et al. Fibroblast cell lines from young adult mice of long-lived mutant strains are resistant to multiple forms of stress. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 23-29 (2005).
- Skarnes, W. C., et al. A public gene trap resource for mouse functional genomics. Nat Genet. 36, 543-544 (2015).
- Baker, K. E., Parker, R. Nonsense-mediated mRNA decay: terminating erroneous gene expression. Curr Opin Cell Biol. 16, 293-299 (2004).
- Shigeoka, T., Kawaichi, M., Ishida, Y. Suppression of nonsense-mediated mRNA decay permits unbiased gene trapping in mouse embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 33, e20 (2004).
- Symula, D. J., Zhu, Y., Schimenti, J. C., Rubin, E. M. Functional annotation of mouse mutations in embryonic stem cells by use of expression profiling. Mamm Genome. 15, 1-13 (2004).
