Summary

Serum serbest Tek tabakalı Kültüründe Fare Embriyonik Kök Hücre Sinir Farklılaşma

Published: May 14, 2015
doi:

Summary

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Abstract

nöral progenitörlerin fare embriyonik kök hücreleri ayırt etmek yeteneği (ESC) nöral özellikleri yanı sıra, daha fazla çalışma için olgun nöral hücre tiplerinin üretimini kontrol eden mekanizmaların çalışmasını sağlar. Bu protokolde serum serbest, tek tabaka kültürü kullanarak sinir atalarıdır için ESC farklılaşması için bir yöntem açıklanmaktadır. yöntem, etkili, ölçeklenebilir ve 4 içinde% 70 nöral projenitör hücrelerinin ~ üretimi ile sonuçlanır – 6 gün. Bu, çeşitli koşullar altında yetiştirilen çeşitli suşlardan ESC uygulanabilir. Sinir progenitörler, mikroskopla fonksiyonel nöronlar ve glia veya analiz içine daha ayırt sitometri veya moleküler teknikler akmasına izin verilebilir. farklılaşma süreci zaman atlamalı mikroskopi için uygun olduğunu ve nöral şartname sürecini izlemek üzere raportör hatlarının kullanımı ile kombine edilebilir. Biz sürecin b izin medya hazırlanması ve hücre yoğunluğu optimizasyonu hakkında ayrıntılı yönergeler sağlarE en ESC hatları ve hücre kültür kapları çeşitli uygulanan.

Introduction

Embriyonik kök hücreler, sinjeneik ya da bağışıklık yetersizliği konaklara (a Kimera oluşturarak) uygun bir aşamada embriyo yeniden yerleştirilmesi, aşağıdaki tüm yetişkin hücre tiplerine farklılaşma yetisine, enjeksiyon koruyarak, in vitro olarak sonsuza çoğalma kapasitesi ile erken embriyodan türetilen pluripotent hücreler (Bir teratom oluşturarak) ya da uygun işaretlere 1 in vitro konu. Nöral soy içine fare embriyonik kök hücrelerinin in vitro farklılaşması ve 1995 tarif edilmiştir ve morfojen retinoik asit ile takviye edilmiş 2-4 serum ihtiva eden ortam içinde çok-hücreli süspansiyon agregatların oluşumunu (embriyoid organları, EBS) yer aldı. O zamandan bu yana çeşitli protokoller nöral farklılaşma 5 izin vermek için geliştirilmiştir. Hala toplanmasını kullanmak Birçok diğerleri hücre tipleri indükleyici ile-kültür co ve çeşitli serum serbest medya kullanımını içerir. Tüm protokoller avantajlara bir olmasınd dezavantajları ve sinirsel hassas doğası veya nöronal hücreleri de kullanılan protokole göre değişir üretti.

İdeal protokol, sağlam ölçeklenebilir olması ve tam olarak tanımlanmış medya ve yüzeylerde faydalanmak, farklılaşma sürecinin non-invazif izleme için uygun olmalı ve mümkün sinirsel atalarıdır saf popülasyonlarının nesil neden dış ipuçlarının tarafından ve ayırt desenli olmak istiyorum nispeten kısa bir süre içinde yüksek verim ve verim bütün nöronal ve glial alt tiplere. Son düzine yıllarda biz bir düşük yoğunluklu, serum serbest yapışık tek tabaka kültürü 6-10 fare ESC nöral atalarıdır ve nöronlar üretmek için bir yöntem kullanıyoruz. Bu protokol, yukarıda belirtilen kriterler içinde, birçok yerine getirir: Elimizdeki farklılaşma verimliliği oldukça uzun yıllar boyunca tutarlı ve hücre çizgileri, çeşitli olmuştur, bu yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir edilebilir (başarıyla 96 oyuklu plakalar, damar kullanımı 15 cm çapında dio kız) ve kullanılan ortam iyi tanımlanmış bulunmaktadır. süreci (dopaminerjik nöronların 6 örneğin, Shh ve FGF8) nöronal alt tiplerinin farklı tiplerinin üretimini indüklemek için ilave edilebilir farklılaşma izlenmesi ve desen ipuçlarının çeşitli timelapse mikroskopi elverişlidir.

Yine, bu protokolün başarılı bir uygulama için bazı zorluklar vardır. Anahtar yönlerinden biri medyanın dikkatli bir hazırlık olduğunu. Biz her zaman ticari alternatiflerin varlığına rağmen içi ortam hazırlar. Kullanılan takviyeleri biri (N2; Protokolü bakınız) standart piyasada mevcut sürümleri üzerinde değişiklikler vardır. Son olarak, bu yöntemin başarılı bir uygulama için en önemli adımlardan biri kaplama optimum hücre yoğunluğudur. Uyaran sinyallerin biri (Fgf4 11) otokrin yapısı gerektirirken, bu yeterli hücre uygun viabil izin vermek için mevcut olması esas olarakçok yüksek yoğunlukları farklılaşma de Sığ ve farklılaşma, (nedeniyle LIF 12 otokrin üretimine muhtemelen kısmen) bozulur. Hem medya hazırlama ve hücre kaplama özenle yapılır ve sürekli optimum sonuçlar sağlamak için bu nedenle önemlidir.

Protocol

1. Medya Hazırlık Not:: 1 oranında, tipik olarak 1, B27 eki ile takviye modifiye N2 ek ve Neurobasal ile desteklenmiş DMEM / F12: Protokol iki ayrı ortam karışımı kullanımına dayanır. 15 ml'lik bir tüp içinde bileşenlerin karıştırılması ile değiştirilmiş N2 ek hazırlayın. Vorteks veya bu filtre etmeyin; çözüm netleşene kadar tersini tüp karıştırın. Daha sonra, (0.01 M HCl içinde yapılır) 25 mg / ml insülin 1 ml ilave edilir ve ter…

Representative Results

Bu deneyde, nöral farklılaşma izlemek için, bir endojen Sox1-GFP raportör ile, fare embriyonik kök hücreleri 46C hücre hattı 14 kullanılır. Sox1 nöral progenitor için bir marker Bu hücre hattı, ifade kullanılarak, yeşil floresan tespit edilebilir. Yoğunluğu Kaplama nöronal farklılaşma elde etmek için kritik bir faktördür. Fare embriyonik kök hücreleri / cm2 10,500 88.500 hücre arasında değişen farklı yoğunluklarda 6-çukurlu plaka içinde plakalanmıştır. …

Discussion

tek tabaka sinir farklılaşma protokolü on üzerinden 6 kullanımda olmuştur. Protokol tanımlanan ortam oluşan ve pratik için sistem daha uygulanabilir kılan bir tek-tabakalı sistemde yapılır, yüksek verimli (örneğin, ilaç tarama) kullanır. Ancak, farklılaşma etkinliğini belirleyen bazı kritik faktörler vardır. Bu makalede, bu faktörleri ve her engel için çözüm işaret ediyor.

Farklılaşma durumu kaplama sonrası hücrelerin yoğunluğu belki de…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Work was funded by a Development and Promotion of Science and Technology scholarship from the Thai Ministry for Education to W.W. and grants from Tenovus and the Anonymous Trust to M.P.S.

Materials

Fetal bovine serum Life Technologies 10270-106
DMEM/F12 Life Technologies 11320-074
Neurobasal medium Life Technologies 21103-049
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Life Technologies A11105-01
B-27 Supplement, serum free Life Technologies 17504-044
Insulin Sigma I6634 Reconstitute with sterile 0.01M HCl
Apo-transferrin Sigma T1147 Reconstitute with sterile water
Progesterone Sigma P8783 Reconstitute with ethanol
Putrescine Sigma P5780 Reconstitute with sterile water
Sodium selenite Sigma S5261 Reconstitute with sterile water
Bovine albumin fraction V Life Technologies 15260-037
L-Glutamine Life Technologies 25030-081 Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented
Gelatine Sigma G1890
6-well tissue culture dish Thermo Scientific 140675
24-well tissue culture dish Thermo Scientific 142475
96-well tissue culture dish Thermo Scientific 167008
GMEM Life Technologies 11710-035
Fetal bovine serum Life Technologies 10270-106
MEM Non-essential amino acids solution Life Technologies 11140-050
Sodium pyruvate Life Technologies 11360-070
2-mercaptoethanol Sigma M7522
Leukaemia inhibitory factor prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods
Tween-20 Sigma P1379
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) Sigma D9542 Protect from light
Mouse anti betaIII tubulin IgG antibody Covance MMS-435P
Fluorescence-labelled anti-Mouse IgG antibody Life Technologies A31571 Protect from light
25cm2 tissue culture flask Thermo Scientific 156367

Referências

  1. Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).
  2. Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
  3. Fraichard, A., et al. In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).
  4. Strubing, C., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons. Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).
  5. Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).
  6. Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).
  7. Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
  8. Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. Development. 134, 2889-2894 (2007).
  9. Stavridis, M. P., Collins, B. J., Storey, K. G. Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation. Development. 137, 881-890 (2010).
  10. Speakman, C. M., et al. Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition. Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).
  11. Kunath, T., et al. FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment. Development. 134, 2895-2902 (2007).
  12. Dani, C., et al. Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway. Dev Biol. 203, 149-162 (1998).
  13. Smith, A. G. Culture and differentiation of embryonic stem cells. Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).
  14. Aubert, J., et al. Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 11836-11841 (2003).
  15. Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).
  16. Silva, J., Smith, A. Capturing pluripotency. Cell. 132, 532-536 (2008).

Play Video

Citar este artigo
Wongpaiboonwattana, W., Stavridis, M. P. Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture. J. Vis. Exp. (99), e52823, doi:10.3791/52823 (2015).

View Video