这个协议描述了从一个9周龄大鼠branchiomeric头肌卫星细胞的分离。肌肉从不同的鳃弓起源。随后,卫星细胞在局部上光毫米大小来研究其分化培养。这种方法避免了卫星细胞的扩增和传代。
Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent problems in speech, swallowing, and sucking. In vitro culture systems that allow the study of satellite cells (myogenic stem cells) from head muscles are crucial to develop new therapies based on tissue engineering to promote muscle regeneration after surgery. These systems will offer new perspectives for the treatment of cleft palate patients. A protocol for the isolation, culture and differentiation of satellite cells from head muscles is presented. The isolation is based on enzymatic digestion and trituration to release the satellite cells. In addition, this protocol comprises an innovative method using extracellular matrix gel coatings of millimeter size, which requires only low numbers of satellite cells for differentiation assays.
约1:500至1:1000的新生儿表现出涉及唇部和/或腭(CLP)的一个裂口;因此,这是在人类1中最常见的先天畸形。软腭肌肉是软腭的讲话,吞咽,吸吮和在运作的关键。如果软腭的裂存在时,这些肌肉异常插入腭骨的后端。
软腭上下移动讲话时,防止空气逸出通过鼻子。在上颚裂儿童没有造成这一现象被称为腭咽功能障碍2,3此控制功能。虽然治疗方案是可变的,软腭修复手术发生在儿童早期(6-36个月龄)4。软腭的异常插入肌肉可手术矫正5-7,然而,在7%的腭咽功能障碍仍然存在,以30%的的患者2,3,8-10。
骨骼肌通过卫星细胞(SCS)的作用,以再生能力是公认11,12。在肌肉损伤,旺被激活并迁移到损伤部位。然后,他们增殖,分化和融合形成新的肌纤维或修复受损的人13。静态旺表达转录因子表达Pax7 14,15,而他们的后代,增殖成肌细胞,另外表达生肌决定因子1(MyoD基因)16。分化成肌细胞开始表达肌细胞(肌细胞生成素)17。成肌细胞的终末分化的标志是形成的肌纤维,和肌特异性蛋白质如肌球蛋白重链(MyHC的)16,18的表达。
最近,一些战略已经在再生医学中用于改善四肢肌肉19-23的肌肉再生。在具体研究branchiomeric头部肌肉也很重要,因为它是最近表明,它们从其它肌肉的不同在几个方面24。与肢体肌肉相反,曾有人建议,branchiomeric头部肌肉含有较少的SCs 25,再生速度慢,并损伤26除之后形成更多的纤维结缔组织,增殖从branchiomeric头部肌肉旺还表示其它转录因子。例如,TCF21,颅面肌肉形成的转录因子中强烈表达再生头部肌肉但几乎在再生肢体肌肉25。在CLP患者的软腭肌肉通常更小,更精心组织比较正常腭肌肉27,28。慢速和快速纤维都存在于软腭肌肉但慢纤维更丰富。与此相反,裂肌含有较高比例的快速纤维,并且还减小毛细管供给与正常软腭肌肉29-31对比。快纤维更容易收缩引起的损伤31-33。伴随毛细血管供血不足也可促进纤维化34,35。手术裂闭合后36所有这些方面可能有助于软腭肌肉穷人再生。鉴于此,一个协议的branchiomeric头肌的SCs的分离和表征是关键的。这提供了研究branchiomeric头部肌肉SC生物学的可能性。此外,可以开发基于组织工程的新疗法手术中电和其他条件损害颅面区域后,以促进肌肉再生。
在一般情况下,许旺可以肌肉组织14的离解后得到。切碎,酶消化,并研磨一般都需要从它们的小生释放旺。雪旺可通过预镀上的未涂覆的菜肴14,37,38进行纯化,果actionation上珀39,40,或fluorescent-或磁性细胞分选41-43。在这里,我们提出了一个新的经济和快速的协议,用于卫星细胞从年轻的成年大鼠branchiomeric头部肌肉的隔离。这个协议是基于一个先前的原稿14,并特别适用于小的组织样本。从代表肌肉旺从第1次,2 次 ,和第 4 次鳃弓始发的分离进行说明。分离后,低数量的卫星细胞都在毫米大小的细胞外基质凝胶点来研究其分化培养。这种方法避免了对旺的膨胀和传代的要求。
雪旺从不同branchiomeric头肌从一个9周龄的Wistar大鼠和对细胞外基质凝胶斑点直接分离培养无需事先膨胀和传代。分离后,将细胞计数并接种在相同细胞密度。对于三种不同的肌肉的平行隔离,这种方法需要大约4小时。为了避免培养污染,一个关键的步骤是快速清洗酒精70%的肌肉解剖后。
期间的SC隔离它切割肌肉组织切成小块(约2mm),但避免过多切碎,因为这将导致由于细胞损伤的小细胞产量是重要的。此外,酶消化的持续时间必须小心地在显微镜下检查,以避免进一步的损害。消化的目的是离解的肌纤维。因为90%以上的分离的细胞的表达表达Pax7,没有进一步纯化是必须的( 图6-8)。这避免了在其它方法,例如在未涂覆的菜肴14,37,38预镀,分馏上的Percoll 39,40额外的纯化步骤,或fluorescent-或磁性细胞分选41,43。对于研磨有必要促使组织碎片和枪头的开口之间的剪切,因为这可以使机械释放的雪旺。如果用10毫升吸管(直径尖端内:1毫米)的研磨是困难的,有5毫升(直径尖端内:2mm)的移液管可以首先使用。或者,玻璃巴斯德移液管可以在所希望的直径被切割和使用。这种方法简单,高效,允许SC从不同的肌肉样本的同时分离。
在培养板的SCs也可以涂有明胶或胶原蛋白,但我们以前的研究表明,细胞外基质凝胶是好得多的肌源性潜力的维护比胶原38。的细胞外基质凝胶斑点毫米级(10微升/ O 2毫米或20微升/Ø4 MM)允许增殖和SCS与细胞的数量有限的分化研究。为分化测定约8至20倍的细胞较少,需要相比于24孔板(直径15.6毫米),以及约80至200倍更少相比毫米至35毫米的培养皿中(直径35 MM)14,38。
由于细胞外基质凝胶是昂贵的,这种方法也更具有成本效益。此外,该室载玻片可由塑料盖来代替滑动,以进一步降低成本。为细胞外基质的凝胶的制备掩护腔室玻片过夜干燥是必不可少的。作为细胞外基质凝胶斑点是透明的,有必要使用背光来标记斑点在底侧。腔室载玻片固定在一个培养皿容易操纵。进一步的细胞培养扩张是没有必要的,它提供了学习的SMAL的雪旺的可能性LER肌肉或小的肌肉样本。可替代地, 例如 ,用于PCR或肌肉构建如果需要更多的细胞,新鲜分离的SCs可以首先在T75烧瓶如上所述扩大。
雪旺分离使用该协议不适合用于进一步纯化用分离后的流动立即术。有链霉蛋白酶消化导致表面的广泛消化抗原14。了用于细胞培养的马血清和胎牛血清首先必须正确表征隔离之前,因为不同的批号不同的影响成肌细胞增殖和分化。
在最近几年,有一种在从鳃弓和头的中胚层( 例如眼外肌)24来自肌肉的兴趣与日俱增。已经清楚地表明,头和四肢肌肉具有高度不同的特性。从旧的动物咬肌似乎重新覃它们的再生能力与四肢肌肉25,26的比较。从种姓眼外肌具有强大的增殖和分化能力堪比从头部肌肉种姓,并显示出更大的潜力植入比四肢肌肉旺24。
光纤类型分布和肌球蛋白组合物之间的肌肉群,也物种之间变化。肌肉从第一鳃弓在人类起源同时包含慢速和快速纤维(IIA亚型和IIX),新生儿肌球蛋白和肌球蛋白典型的发展中国家心肌。在这些啮齿动物的肌肉含有约95%的快速纤维肌球蛋白IIa和IIb)44-46。研究禽流感的肌肉显示,从不同的肌纤维类型不同种姓的分化能力。从快速纤维只种姓分化成快肌纤维,而从慢纤维旺能分化成两种类型的纤维47。此外,旺中快肌的百分比纤维比在慢肌纤维48,49更低。这表明,纤维型分布,必须考虑到对研究上的肌肉在颅面区域。类似的腭裂的肌肉,在啮齿动物的LVP包含几乎完全快纤维50。出于这个原因,从LVP种姓适用于腭裂的领域临床前研究。
该协议提供了新的可能性,研究从branchiomeric头部肌肉或其他肌肉更小或更小的肌肉样本得到旺。这将有利于新的疗法的开发,以改善肌肉在颌面区域中的条件的再生如腭裂而且在影响较小的肌肉的其他条件。
The authors have nothing to disclose.
This study was funded by a Mosaic grant (017.009.009) from The Netherlands Organization for Scientific Research (NWO) and a Start grant (S-13-167C) for young investigators from the AO Foundation. Z.Y.R is supported by the National Institutes of Health (grant # AG021566, AG035377, NS090051).
Hypodermic Needle 25G 0,5x25m | BD Microlance | 300400 | |
Dissecting scissors | Braun | BC154R | |
Micro forceps straight | Braun | BD330R | |
Surgical Scalpel Blade No.15 | Swann-Morton | 0205 | |
Alcohol 70% | Denteck | 2,010,005 | |
Permanox Slide, 8 Chamber | Thermo Scientific | 177445 | |
6 well cell culture plate | Greiner bio-one | 657160 | |
Cell Culture Dishes (100 x 20 mm) | Greiner bio-one | 664160 | |
15 ml sterile conical centrifuge tube | BD Biosciences | 352097 | |
50 ml sterile conical centrifuge tube | BD Biosciences | 352098 | |
Cell strainer (40 μm) | Gibco | 431750 | |
10 mL serological pipette | Greiner bio-one | 607180 | |
20µL FT20 | Greiner bio-one | 774288 | |
Matrigel, Phenol-Red Free | BD Biosciences | 356237 | 10 mL |
Pronase | Calbiochem | 53702 | 10KU |
Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | 500 mL |
Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569-010 | 500 mL |
Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 3600511 | 500 mL |
Horse Serum | Gibco | 26050088 | 500 mL |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | 100 mL |
Chicken Embryo Extract | MP Biomedicals | 2850145 | 20 mL |