Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.
O comportamento é controlado pelo sistema nervoso. Imagem de cálcio é um método simples no nematóide Caenorhabditis elegans transparente para medir a actividade dos neurónios durante vários comportamentos. Para correlacionar com actividade neuronal comportamento, o animal não deve ser imobilizada, mas deve ser capaz de se mover. Muitas mudanças comportamentais ocorrem durante escalas de tempo longos e exigem a gravação ao longo de muitas horas de comportamento. Isto também faz com que seja necessário para a cultura os vermes na presença de alimentos. Como vermes podem ser cultivadas e sua atividade neural fotografada em escalas de tempo longos? Agarose MicroChamber Imagem (AMI) foi desenvolvido anteriormente para a cultura e observar pequenas larvas e agora foi adaptado para estudar todas as fases da vida do início L1 até o estágio adulto de C. elegans. AMI pode ser realizada em vários estágios da vida de C. elegans. Imagem de cálcio a longo prazo é conseguido sem imobilizar os animais usando exposições de curta acionadas externamente comcombinada com um elétron multiplicação de carga acoplada gravação dispositivo (EMCCD) câmera. Diminuir o zoom ou a digitalização pode escalar até este método para a imagem até 40 vermes em paralelo. Assim, é descrito um método para o comportamento e actividade neural imagem em escalas de tempo longos em todas as fases da vida de C. elegans.
Caenorhabditis elegans has been established as a model system to study behavior1. Due to its amenability to genetics, the molecular and cellular mechanisms underlying behavior can be studied. Many behaviors occur on long time scales. Two principal approaches can be used to observe motile animals over long time scales. The first approach is following the animal during movement using an automated stage or camera2-8 and the second is to restrict the movement to a range that is at least as small as the field of view of the camera9-14. Both methods have their advantages. Tracking allows following an animal over long spatial ranges but limits the number of animals that can be discerned in one experiment. Restricting the movement of the animals allows scaling up the observation to many individuals at the same time by using arrays of restricted compartments.
Because the nematode is transparent, live fluorescent imaging can be performed non-invasively15. Calcium imaging provides a functional readout for the activity of excitable cells and is established for C. elegans16-20. Calcium enters the cell via channels in the plasma membrane that open upon depolarization. Thus, calcium acts as a proxy for neural activity. Calcium sensors can be grouped in two major classes, ratiometric and non-ratiometric sensors. Both classes employ conformational changes of calcium-binding proteins induced upon binding of calcium. Ratiometric sensors contain two fluorescent proteins. When the lower-wavelength fluorescent protein is excited, a part of the light energy is transmitted to the higher wavelength fluorescent protein as a function of their distance in a process called Fluorescence Resonance Energy Transfer or Förster Resonance Energy Transfer (FRET)21. Non-ratiometric sensors are based on circularly permuted GFP and employ de-quenching of the fluorophore caused by calcium binding22. Each class has its advantages. While ratiometric sensors are less sensitive to movement or expression artifacts, non-ratiometric sensors typically have a higher dynamic range. Both ratiometric and non-ratiometric sensors have been useful to study the activity of excitable cells in C. elegans16-20,23,24.
When doing long-term fluorescence imaging, the experimenter will have to deal with several potential challenges: 1. Disturbance of behavior through excitation light: Worms are sensitive to short-wavelength fluorescence excitation light and avoid light from the violet to blue range that is used for calcium imaging25,26. Worms respond with either a backward or a forward escape response25,26. Thus, the amount of light needs to be controlled. 2. Bleaching of the fluorescent sensor protein: Often, bleaching of the fluorescent protein hampers long-term imaging. Typically, however, light intensities that are needed to observe bleaching are higher than the light intensities that cause disturbing effects on the behavior of the animals. Thus, bleaching is only a theoretical problem in this type of calcium imaging. 3. Worms inside the microchambers are not fixed and move constantly during wake behavior and images may appear blurred if the worm is not immobilized. All these challenges can be solved using extremely short exposure times with low light intensity. This can be realized by using a highly sensitive EMCCD camera with short exposure times and external triggering of a light emitting diode (LED). To expose the worms to the illumination light as briefly as possible (only during the exposure time of the camera) the LED is externally triggered using a transistor-transistor logic (TTL) signal that the camera emits during exposure resulting in an illumination of the worm for precisely the time the camera chip is exposed. This also means that the EMCCD chip will be dark during data readout, which is optimal for readout performance of this chip.
Previously, agarose microchambers have been developed for long-term fluorescence imaging of C. elegans larvae9. Here, it is described how agarose micro-chambers can be used for long-term calcium imaging for any life stage of C. elegans, how calcium imaging can be performed, and how this method can be upscaled to assay many individual worms in parallel.
Equipamento
O foco de um microscópio normalmente deriva durante a aquisição de imagem a longo prazo. Para microscópios compostos, o foco de manutenção de sistemas podem ser adquiridos a partir dos principais fabricantes de microscópios. No caso de um microscópio composto com controle de foco é muito caro, uma alternativa simples seria usar um microscópio estereoscópico. Microscópios compostos permite o uso de objectivos com elevada abertura numérica (NA) e pode ser facilmente automatizado. Objectivos de petróleo 40X estão bem adaptados. Lentes de imersão em água não são ideais por causa da evaporação durante a imagem a longo prazo. Contraste de interferência diferencial (DIC) gera um contraste agradável que ajuda a acompanhar as alterações morfológicas e comportamentais, mas simples imagem de campo claro, também pode ser usado. Para DIC ou imagiologia campo brilhante, usar luz vermelha por colocação de um filtro de luz vermelha para o caminho do dia-a iluminação do microscópio. Para a digitalização de vários microchambers uma etapa automatizada é necessária. Melhor desempenho é achieved quando uma etapa é usado que tem aceleração e desaceleração não-linear e pode ser ajustado para baixo velocidade de digitalização para evitar perturbar os animais durante a digitalização. Não observamos respostas comportamentais ou aumento de cálcio nos neurônios mechanosensitive (ALM e PLM) durante a digitalização, o que sugere que a digitalização lenta na verdade não ativa o sistema mechanosensitive do worm (dados não mostrados). Sistemas comerciais de LED pode ser usado. Várias empresas oferecem soluções prontas para uso, que incluem os LEDs em diferentes comprimentos de onda. O LED deve ter a opção de desencadear externamente o LED com um sinal TTL. Uma câmera altamente sensível é necessário para geração de imagens de cálcio de mover os animais. Câmeras EMCCD são as câmeras mais sensíveis no mercado. A câmera precisa ter uma saída TTL durante a exposição (também chamado de saída "fogo"). Um aquecedor de tampa é necessário para evitar a condensação sobre a tampa se utilizando um microscópio invertido. Em um microscópio vertical, o prato vai ser colocada de modo que a tampa Wiestará na parte inferior e, assim, evitar condensação e sem aquecimento tampa é necessária. A tampa deve fechar-se hermeticamente o recipiente para evitar a evaporação de água durante o exame a longo prazo.
PDMS selos
A superfície do selo PDMS que contém a estrutura de moldagem para a agarose é Moderada da lâmina de vidro, que suporta o selo PDMS. Uma lista com as empresas que oferecem chips personalizados microfluídicos podem ser encontrados no Wikipedia ( http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies ).
Encher os nematóides em suas câmaras
Este é o passo mais crítico no protocolo e os seguintes pontos devem ser considerados: A) A umidade do agarose é crucial para a transferência dos vermes e para a imagem latente. Se a agarose é muito úmido, ou seja, há uma cov líquidorando uma área de vários microchambers, não será possível para distribuir alimentos de bactérias e vermes de uma maneira controlada, porque o líquido irá tornar as bactérias escoar-se. Se a agarose é muito seco, em seguida, as bactérias e vermes não pode sair da picareta facilmente o que significa que o aumento da força precisa ser usada para soltar os vermes e bactérias que facilmente provoca danos ao agarose. Ao preencher um monte de vermes a agarose pode secar. No pior dos casos a agarose será tão seco no final que as câmaras entrará em colapso. Se a agarose é demasiado seco pode ser re-hidratado, colocando uma pequena gota (cerca de 2 ul) de S-basal para o lado do chip onde não existem vermes. Em seguida, mergulhar o fio de platina pegar no líquido e até mesmo puxar algum do líquido para dentro da área onde as câmaras são cheias com vermes. B) A quantidade de alimentos é fundamental para a imagem latente de sucesso a longo prazo. Se não há comida suficiente, os vermes podem ficar sem ele. Se houver excesso de comida na cavidade da câmaranão se comportará como um líquido, mas sim como um sólido e permitirá vermes para escapar da câmara, empurrando as bactérias. Destinam-se a obter uma suspensão bacteriana que preenche toda a câmara. Os vermes estão em constante contacto físico com a superfície de agar e de vidro ao longo da maioria do seu comprimento durante a experiência e a rastejar comportamento parece ser similar ao movimento sobre um prato e diferente de debulha em líquido. C) Mecânica prejudicial do agarose pode arruinar a experiência. Uma escolha bem é essencial. Ele não deve ter cantos afiados. Uma pestana macio ligado a uma ponta de pipeta pode ser usado para mover as bactérias ou vermes para dentro das câmaras, em vez de usar uma palheta de platina. Na maioria dos casos, no entanto, completamente seca de agarose é a razão para danos. A picareta ou cílios deve, idealmente, apenas a apenas tocar a própria agarose, e a película de água na superfície da agarose deve retirar vermes e bactérias. Quando as câmaras de selagem, mais uma vez, a humidade da agarose é essencial. Não deveser qualquer líquido livre na superfície de agarose porque esta pode lavar as bactérias e os vermes durante a selagem. Grandes bolhas pode ser removido levantando suavemente um canto da placa de agar. Pequenas bolhas que são menores do que a câmara muitas vezes ficam presos dentro das câmaras. Essas bolhas não são um problema e vai desaparecer por absorção. Depois de montar o prato, verifique novamente que a agarose não é muito seco nem muito úmido. As câmaras devem ser bem vedados e não deve haver qualquer fluxo de líquido entre as câmaras. Se a agarose é muito úmido, as câmaras não veda corretamente. Worms pode escapar ou seus alimentos serão lavados. Se a amostra for muito úmido, simples abrir a tampa e deixe secar agarose por um minuto ou dois. Se a agarose é muito seco, as câmaras podem entrar em colapso e os vermes vai escapar.
Intensificação por diminuir o zoom
Para imagens de fluorescência, zoom out é limitada pela baixa quantidade de luz obtida em ampliações inferiores. Além disso, ECâmeras MCCD são otimizados para a sensibilidade e muitas vezes têm uma resolução relativamente baixa. No entanto, ampliação de imagem quatro vezes é bem possível. Por exemplo, quatro câmaras de 190 mm x 190 mm pode caber em um quadro quando usando 140x ampliação (conseguido através de um 20X Objective e uma câmera 0,7X de montagem) e um pixel 512 x 512, câmera de 8 x 8 mm. A câmera de alta resolução com um grande chip (como câmeras scmos, 16,6 milímetros x 14 mm Chip, 2560 x 2560 pixels = 5.5 Megapixel) otimiza a intensificação das DIC e brilhante imaging campo. Por exemplo, até 30 vermes L1 em 190 mm x 190 mm câmaras podem caber em cada frame da câmera ao usar um aumento de 100x (ver Figura 3). Em princípio, o zoom e a digitalização pode também ser combinados para obter um número ainda maior de animais. A maioria dos neurônios ficar muito bem em foco, de modo que apenas um plano focal precisa ser trabalhada. Se os neurônios são encontrados para sair do foco, AZ varredura usando uma unidade piezo podem ser tomadas a cada vez que point.
Adaptação a diferentes comportamentos
Este protocolo dá uma boa idéia do comportamento através de escalas de tempo. Obviamente, o calendário das explosões deve ser adaptado a diferentes comportamentos e fases da vida.
Limitações da técnica
Vários fatores limitam a duração da imagem. O mais importante é a quantidade de alimentos. Uma vez que a comida é consumida, parar o desenvolvimento de larvas. Assim, em pequenas câmaras (190 x 190 ^ m) vermes desenvolver até o estádio L3 e então prender. Se for necessária uma maior tempo de imagem, câmaras maiores têm de ser usado. A duração máxima da imagem latente a longo prazo está na gama de 2,5-3 dias. Se mais de imagem for necessária, as minhocas precisam ser recuperados e colocados em novas câmaras. Quando imagiologia vermes adultos, outra limitação é causada pela prole destes vermes. Vermes adultos põem ovos a partir do qual as larvas eclodem. Essas larvas também vai ficar dentro da câmara, Consumir alimentos, e podem perturbar a análise de imagem. Se prole é um problema, a solução é usar tanto adultos estéreis ou para colocar repetidamente os vermes em câmaras frescas. Para recuperar vermes, a laje de agarose contendo a câmara é cortado com um bisturi livre, é puxado para fora da lamela, e é colocado numa placa de NGM a partir do qual os vermes podem ser recuperados. Outro limite é a restrição dos vermes para áreas relativamente pequenas. Isto pode ser um problema se o movimento de longo alcance deve ser analisado. Enquanto os animais nas câmaras pode ser estimulada mecanicamente e optogenetically 21,27,34,35, a natureza estanque da câmara fará com que seja difícil aplicar estimulantes solúveis ou voláteis. Gases biologicamente importantes, tais como o oxigénio ou o dióxido de carbono podem livremente difundir no agar. O grande reservatório de ar no prato deve manter as concentrações de gases nas câmaras constantes durante o tempo necessário para as experiências. No entanto, deve ser mantido em mente que o Concentraçã oxigénio locaisn na câmara pode assemelhar-se mais as condições encontradas na cultura líquida do que na placa de cultura.
Significativas relativamente a métodos existentes
Dispositivos microfluídicos têm muito avançado comportamento e de desenvolvimento estudado em C. elegans. Frequentemente, as estruturas são feitas de microfluidos de PDMS 12. Aqui, descrevemos um protocolo para a geração de câmaras de cultura de microfluidos feitas a partir de agarose. A força desta técnica é a combinação de alta qualidade de imagem, a correlação de comportamento com as medições fisiológicas, imagiologia de longo prazo, e um razoavelmente elevado rendimento. Alta qualidade de imagem é obtida por imagem através da lamela de vidro usando objetivos elevados de NA. Como resultado, imagens de fluorescência, tais como imagiologia de cálcio e de imagem confocal de estruturas subcelulares pode ser realizada. Uma vez que os animais não são imobilizados como noutros sistemas, que permite um comportamento de correlação com as medições fisiológicas. Because os animais têm comida suficiente, eles continuam desenvolvendo permitindo imaging longo prazo. Este sistema pode imagem muitos vermes em uma corrida porque os animais estão restritos a suas câmaras definidas. Assim, este método pode ser facilmente dimensionado para cima 9,27,34-36.
As aplicações futuras
Até agora, este sistema tem sido usado principalmente para estudar o comportamento do sono em C. elegans larvas L1. No entanto, a adaptação a todas as fases, será possível estudar uma grande variedade de comportamentos também em dauers e adultos. Uma grande variedade de comportamentos pode ser estudada com esta técnica que varia de acasalamento para a postura dos ovos.
The authors have nothing to disclose.
A Sociedade Max Planck e um estipêndio Göttingen Graduate School Grupo Junior à HB financiou este trabalho.
high-melting point agarose | Fisher Bioreagents | BP(E)164-1000 | |
Top Vision Low Melting Point Agarose | Thermo Scientific | R0801 | |
LED system | CoolLED | pE-2 | |
compound microscope | Nikon | TiE | |
stereomicroscope | Leica | M5 | |
EMCCD camera | Andor | iXon 897 | now sold as iXon Ultra 897 |
sCMOS camera | Andor | Neo | |
plasma cleaner | Harrick | PDC-23G2 | |
lid heater | MPI workshop | custom made | |
plastic dish | Falcon | 08-757-100A | |
z-stage for the microscope | Prior | Nano Scan Z | |
x-y-stage for the microscope | Prior | Proscan III | |
PDMS stamp | Abbott Laboratories | custom made | |
red light filter | Chroma | ET660/50m | |
35mm petri dish | Falcon | Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning | |
double sided sticky tape | Sellotape/Henkel | double sided 12mm x 33 m | alternatively Advance double sided sticky tape from Rubance Adhesives can be used. |