Mus naive CD4⁺ T Cell Isolasjon og<em> In vitro</em> Differensiering i T cell Subsets

Konseptet med distinkte linjer eller undergrupper av CD4 ⁺ T helper (Th) celler har eksistert siden siste del av det ^20. århundre ^en. Anerkjennelse av beslektet antigen i nærvær av ko-stimulerende signaler resulterer i flere runder med cellulær proliferasjon og den endelige differensiering til effektor Th-celler. Typen av Th-celle generert i løpet av denne prosessen er avhengig av cytokin miljø tilstede under aktiveringen ^2. I begynnelsen var naive Th-celler tenkt å polar inn to distinkte linjene følgende T-celle reseptor (TCR) aktivisering, kostimulerende CD28 ligation, og cytokin signalering. Type 1-hjelperceller (Th 1) er kjennetegnet ved deres effektor produksjon av IFNy cytokin, så vel som deres krav for IL-12 signalisering i løpet av differensieringsprosessen ^3,4. Til slutt ble det oppdaget at differensierte Th1-celler har en genetisk profil som er mest karakteristiske preget by uttrykk for T boksen familie transkripsjonsfaktor, Tbx21 (T-bet), som regnes som hoved regulator av Th1 genetisk program ^5. Videre kan IL-12, så vel som IFNy fremmer T-bet ekspresjon ^6,7. I immunrespons, Th1-celler er viktige for verten forsvar mot intracellulære patogener samt sterke arrangører av autoimmun betennelse. I motsetning til dette, type 2-hjelperceller (Th2) krever IL-4 for deres utvikling og deres effektor cytokiner, inkludert IL-4, IL-5 og IL-13, er viktig for å drive B-celle responser og er patogene i allergi ^{8, 9.} I likhet med Th1-celler, ble Th2-celler funnet å uttrykke sin egen herre transkripsjonell regulator, betegnes GATA-3 ^10,11. Interessant, tilstedeværelse av polariserende cytokiner og generering av en bestemt Th avstamning er antagonistisk til utvikling av andre, ^2,12, noe som tyder på at bare en bestemt Th undergruppe kan bli dominerende under en immungjenrespons.

Etter identifikasjon av Th1 og Th2-cellelinjer, har ytterligere arbeid vist enda mer unik undergrupper av T-hjelperceller, inkludert follikulær hjelper (TFH), IL-9-produserende (Th9), og IL-22-produksjon (Th22) (nylig anmeldt i ^13). Ved anvendelse av in vitro differensiering eksperimenter, vil denne protokollen fokusere ytterligere bare på to Th undergrupper, betegnet regulatoriske T-celler (treg) og IL-17-produksjon av CD4 ⁺ T-celler (Th17). CD25 ⁺ regulatoriske T-celler kan skje naturlig (nTreg) i thymus; naive Th-celler kan også fremkalles (iTreg) til å bli regulatorisk i periferien (anmeldt i ^14,15). Begge typer Tregs uttrykke et karakteristisk transkripsjonsfaktor betegnet gaffelhodeboks P3 (foxp3), som er avgjørende for deres effektor undertrykkingsmekanismer som omfatter oppløselige anti-inflammatorisk mediator produksjon, IL-2-forbruk, og celle-kontakt-avhengige mekanismer ^14,15. Mangelen på Foxp3 uttrykk gir en alvorlig, multi-organ autoimmun lidelse kalt immunfeilregulering, polyendocrinopathy, enteropati, X-bundet syndrom (IPEX), demonstrere kritisk rolle denne Th undergruppe i å løse betennelse og regulere perifer toleranse for selv antigener ^16. In vitro, naive CD4 ⁺ T-hjelperceller oppregulerer foxp3 og bli forpliktet til treg programmet ved stimulering med IL-2 og TGF-β ^14,15. Det kan være moderat til stor plastisitet i CD4 ⁺ T-celle-cellelinjer, spesielt når man vurderer bare cytokinproduksjon (oversikt i ^17,18). Men i forbindelse med in vitro differensiering protokoller, vi skal diskutere hver undergruppe som en unik avstamning.

Nylig ble en undergruppe av Th17-celler som produserer IL-17 cytokin identifisert som et unikt avstamning med proinflammatoriske funksjoner som er særlig patogene under autoimmun inflammasjon ^19-21. Th17 celler uttrykker en unik transkripsjonsfaktor, kalt retinoid relaterte foreldreløs reseptor gamma t (RORγt) som koordinerer Th17 genetisk program ^22. TGFp er viktig for generering av Th17 avstamning gjennom induksjon av RORγt. Imidlertid er effekten av TGFp signale antas å bare indusere Th17 satsing på synergizing med IL-6 (anmeldt i ^12). Videre studier har vist at en rekke andre signaler som positivt kan regulere Th17 engasjement, inkludert IL-1β, økt natrium og TLR signale ^23-26. Andre rapporter har antydet at de patogene Th17-celler in vivo, er de som faktisk omgår TGFp signalering og i stedet stole på en kombinasjon av IL-1, IL-6 og IL-23 for ²⁷ deres differensiering. Således kan Th17-celler være avledet fra en rekke forskjellige signalveier; for anvendelsen av denne protokollen, vanlig brukte (TGFp og IL-6) veien for Th17 avstamning engasjementvil bli presentert.

Differensieringen protokollen beskrevet under for alle effektor linjene er avhengig av fast antistoff som stimuli for TCR og CD28 gjennom hele løpet av eksperimentet. Men andre har vist at TCR aktivering med antigen-presenterende celler ²⁸ eller tverrbinding anti-CD3 og anti-CD28-antistoffer med hamster-antistoff i 2 dager, ²⁹ er også svært effektivt middel for å indusere dannelsen av forskjellige Th-undergrupper. Protokollen presenteres her bygger på tidligere rapporterte metoder for å isolere murine CD4 ⁺ T-celler fra sekundære lymfoide organer ³⁰ og generere Th17 celler ^31. En hovedforskjell er at denne protokollen er avhengig av bruk av en cellesorterer å isolere naive CD4 ⁺ T-celler fra lymfevev. Men mange bedrifter nå tilby raske separasjons kits som kan berike for naive CD4 ⁺ T-celler, som kan være i stand til å omgå kravet feller sortering, avhengig av forsøket. De fremgangsmåter og reagenser som er presentert i denne protokollen er det vi rutinemessig bruk, og finner for å være den mest effektive. Men husk at alternative reagenser og metoder finnes for mange av trinnene som presenteres nedenfor, og det er opp til den enkelte lab for å finne ut hva som fungerer best for deres formål.