Summary

マウスナイーブCD4<sup> +</sup> T細胞の単離と<em>インビトロ</em> T細胞サブセットへの分化

Published: April 16, 2015
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Summary

Naïve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of naïve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Abstract

Antigen inexperienced (naïve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a naïve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during naïve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of naïve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing naïve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Introduction

CD4 + Tヘルパー(Th)細胞の明確な系統またはサブセットの概念は、20 世紀1の後半から出回っている。細胞増殖と細胞のThエフェクターへの最終的な分化のいくつかのラウンドで共刺激シグナルの結果の存在下で同族抗原の認識。このプロセスの間に生成されたTh細胞のタイプは、活性化2中に存在するサイトカイン環境に依存する。最初に、ナイーブTh細胞は、T細胞受容体(TCR)活性化、共刺激CD28のライゲーション、およびサイトカインシグナル伝達以下、2つの異なる系統に分極すると考えられていた。 1型ヘルパー細胞(Th1が)IFNγサイトカインのそのエフェクター生産ならびに分化プロセス3,4の間にIL-12シグナル伝達に対するそれらの要件によって特徴付けられる。最終的には、分化したTh1細胞は、ほとんど区別bとを特徴とする遺伝的プロファイルを有することが発見されたYのTh1遺伝的プログラム5のマスターレギュレーターと考えられているTボックスファミリー転写因子の発現、Tbx21(T-BET)、。さらに、IL-12と同様にIFNγは、T-bet発現6,7を促進することができます。免疫応答を、Th1細胞は、細胞内病原体、ならびに自己免疫性炎症の強力なプロモーターに対する宿主防御のために重要である。対照的に、2型ヘルパー細胞(Th2の)は、それらの開発のためのIL-4およびIL-4、IL-5を含むそれらのエフェクターサイトカイン、およびIL-13を必要とし、B細胞応答を駆動するために重要であり、アレルギー8において病原性であり、 9。 Th1細胞と同様に、Th2細胞は、自分のマスター転写調節因子を発現することが見出された、GATA-3 10,11と称される。興味深いことに、偏サイトカインの存在と特定のTh系統の世代は、特定のThサブセットが、免疫再中に優勢になることを示唆している、他人2,12の発展に拮抗的であるsponse。

Th1とTh2の系統の同定以来、最近(、さらなる作業は濾胞ヘルパー(TFH)、IL-9産生(TH9)を含むヘルパーT細胞のさらに多くのユニークなサブセットを、実証した、およびIL-22を産生する(TH22) 13で)検討。 in vitroでの分化実験のために、このプロトコルは2つだけ追加のThサブセットに焦点を当て、調節性T細胞(Treg細胞)およびIL-17産生CD4 + T細胞(Th17細胞)と呼ばれる。 CD25 +制御性T細胞は胸腺で自然に(nTreg)が発生することがあります。ナイーブTh細胞はまた、(14,15に総説)周辺の規制になるために(iTreg)を誘導することができる。 Tregの両方のタイプの特性転写因子を発現し、可溶性抗炎症性メディエーター産生、IL-2の消費、および細胞接触依存性の機構14,15を含み、それらのエフェクター抑制メカニズムにとって重要であるフォークヘッドボックスP3(Foxp3の)は、と呼ばれる。 Foxpの欠如深刻な、多臓器自己免疫疾患の3式の結果は、炎症を解決し、自己抗原16に末梢寛容の調節におけるこのThのサブセットの重要な役割を実証し、免疫調節異常、内分泌腺、腸、X連鎖症候群(IPEX)と呼ばれる。アップレギュレートするのFoxp3およびIL-2による刺激のTregプログラムにコミットなり14,15 TGF-βin vitroでのナイーブCD4 + Tヘルパー細胞。 (17,18に総説)はサイトカイン産生を検討する場合は特に、CD4 + T細胞系統のかなりの可塑性の中等度があってもよい。しかし、in vitroでの分化プロトコルの目的のために、我々は、ユニークな系統として各サブセットを議論する。

最近、IL-17のサイトカインを産生するTh17細胞のサブセットは、自己免疫炎症19-21の間、特に病原性の炎症促進性機能を有するユニークな系統として同定された。 Th17細胞は、固有の転写因子を発現し、Th17の遺伝的プログラム22を調整レチノイド関連オーファン受容体γトン(のRORγt)と呼ばれる。 TGFβは、RORγtの誘導を介してのTh17系統の世代のために重要である。しかしながら、TGFβシグナル伝達の効果のみ(12日)、IL-6と相乗際のTh17コミットメントを誘導すると考えられている。さらなる研究は、他の正IL-1βを含む、Th17細胞のコミットメントを調節することができる信号が増加ナトリウム、およびTLR種々の23-26をシグナリングすることを示した。他の報告では、 インビボで病原性Th17細胞が実際TGFβシグナル伝達をバイパスするものであり、その代わりに、それらの分化27 IL-1、IL-6、およびIL-23の組み合わせに依存することを示唆している。したがって、Th17細胞は、シグナル伝達経路の様々な由来してもよい。 Th17の系譜コミットメントのためにこのプロトコルの目的のために、一般的に使用される(TGFβおよびIL-6)経路表示されます。

すべてのエフェクター系統のために以下に記載される分化プロトコルは、実験の全過程を通じて、TCRおよびCD28のための刺激として固定した抗体に依存しています。しかし、他の2日間29抗原提示細胞28またはハムスター抗体と架橋抗CD3および抗CD28抗体によるTCR活性化は、様々なThのサブセットの生成を誘導する非常に有効な手段であること。実証されているここに提示されたプロトコルは、Th17細胞31を二次リンパ器官30から、マウスCD4 + T細胞を単離および生成するための以前に報告された方法を上に構築する。一つの大きな違いは、このプロトコルは、リンパ組織からのナイーブCD4 + T細胞を分離するセルソーターの使用に依存することである。しかし、多くの企業が要件fのをバイパスすることができる可能性が、ナイーブCD4 + T細胞を濃縮することができ迅速な分離キットを提供または実験に応じてソート。このプロトコルで提示方法および試薬は、私たちが日常的に最も効果的に使用すると何を見つけるです。しかし、別の試薬および方法論は、以下に提示手順の多くのために存在し、それが彼らの目的のために最適に動作されるか決定するために、個々の研究室次第であることに留意してください。

Protocol

全ての実験手順は医学と科学のロザリンド·フランクリン大学環境健康と安全のオフィスによって承認されたプロトコルを使用して実行されます。このプロトコルに使用される(NCIから購入)C57BL / 6マウスは、特定病原体を含まない条件下で飼育し、そしてすべての動物実験は医学ロザリンドフランクリン大学の施設内動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されたプロトコルを使用して実…

Representative Results

分化の分析のための時点は、試験されるThの条件ならびにT細胞受容体活性化の強さに応じて変えることができる。分化の2~3日後、細胞はT細胞増殖の程度を決定するために、光学顕微鏡によって可視化することができる。細胞の大規模な増殖および凝集を示すウェルは、最も可能性が高いと考え、培養中の4日後にメディアを排出し、外因性IL-2、そのようなTh1とTh2などのほかに頼って4日目分化…

Discussion

脾臓はナイーブThの細胞を含んでいるが、リンパ節におけるこの集団の割合がはるかに高い。適切にこのプロトコルでリンパ節を識別して削除に失敗すると、ナイーブ細胞の貧弱な収量になります。これは、より多くの脂肪組織を有する老齢マウスまたは雄マウスでは特に困難である。 図1に示すように、動物の四肢や皮膚の適切な固定及びピニングがアクセス可能な外部のリン?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者は、このプロトコルの最適化のためにテキサス大学MDアンダーソンがんセンターの大学の医学と科学のロザリンド·フランクリン大学のレイノルズラボのすべてのメンバー、および陳ドンラボに感謝したいと思います。この作品は、国立衛生研究所(K22AI104941)からJMRの助成金によってサポートされていました。

Materials

Complete RPMI: Warm in a 37 oC water bath before use
RPMI 1640 Media Life Technologies 11875119
10 % FBS Life Technologies 26140-079
1000X 2-mercaptoethanol Life Technologies 21985023
100X Pen/Strep Life Technologies 15140122
100X L-glutamine Life Technologies 25030081
120 micron nylon mesh Amazon CMN-0120-10YD Cut into 2 cm2 squares and autoclave
Alternative: 100 micron cell strainers Fisher 08-771-19 Alternative to cutting nylon mesh
autoMACS running buffer Miltenyi 130-091-221 Warm in a 37 oC water bath before use
autoMACS rinsing solution Miltenyi 130-091-222 Warm in a 37 oC water bath before use
CD4 beads Miltenyi 130-049-201
ACK lysis buffer Life Technologies A10492-01
Cytokines:
Human (h) IL-2 Peprotech 200-02
Recombinant mouse (rm) IL-4 Peprotech 214-14
rmIL-6 R & D Systems 406-ML-025
rmIL-12 Peprotech 210-12
hTGFb R & D Systems 240-B-010
Antibodies:
2C11 (anti-CD3) BioXcell BE0001-1
37.51 (anti-CD28) BioXcell BE0015-1
11B11 (anti-IL-4) BioXcell BE0045
XMG1.2 (anti-IFNg) BioXcell BE0055
anti-CD62L-FITC BioLegend 104406 Use at 1:100
anti-CD25-PE BioLegend 102008 Use at 1:400
anti-CD4-PerCP BioLegend 100434 Use at 1:1000
anti-CD44-APC BioLegend 103012 Use at 1:500
Phorbol  12-myristate 13 acetate (PMA) Sigma-Aldrich P-8139 Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC
Ionomycin Sigma-Aldrich I-0634 Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC
Brefeldin A eBioscience 00-4506-51 Use at 1:1000

Referências

  1. Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A., Coffman, R. L. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J Immunol. 136 (7), 2348-2357 (1986).
  2. Dong, C., Flavell, R. A. Cell fate decision: T-helper 1 and 2 subsets in immune responses. Arthritis Res. 2 (3), 179-188 (2000).
  3. Hsieh, C. S., et al. Development of TH1 CD4+ T cells through IL-12 produced by Listeria-induced macrophages. Science. 260 (5107), 547-549 (1993).
  4. Seder, R. A., Gazzinelli, R., Sher, A., Paul, W. E. Interleukin 12 acts directly on CD4+ T cells to enhance priming for interferon gamma production and diminishes interleukin 4 inhibition of such priming. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (21), 10188-10192 (1993).
  5. Szabo, S. J., et al. A novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment. Cell. 100 (6), 655-669 (2000).
  6. Afkarian, M., et al. T-bet is a STAT1-induced regulator of IL-12R expression in naive CD4. T cells. Nat Immunol. 3 (6), 549-557 (2002).
  7. Zhu, J., et al. The transcription factor T-bet is induced by multiple pathways and prevents an endogenous Th2 cell program during Th1 cell responses. Immunity. 37 (4), 660-673 (2012).
  8. Le Gros, G., Ben-Sasson, S. Z., Seder, R., Finkelman, F. D., Paul, W. E. Generation of interleukin 4 (IL-4)-producing cells in vivo and in vitro: IL-2 and IL-4 are required for in vitro generation of IL-4-producing cells. J Exp Med. 172 (3), 921-929 (1990).
  9. Swain, S. L., Weinberg, A. D., English, M., Huston, G. IL-4 directs the development of Th2-like helper effectors. J Immunol. 145 (11), 3796-3806 (1990).
  10. Zhang, D. H., Cohn, L., Ray, P., Bottomly, K., Ray, A. Transcription factor GATA-3 is differentially expressed in murine Th1 and Th2 cells and controls Th2-specific expression of the interleukin-5 gene. J Biol Chem. 272 (34), 21597-21603 (1997).
  11. Zheng, W., Flavell, R. A. The transcription factor GATA-3 is necessary and sufficient for Th2 cytokine gene expression in CD4 T cells. Cell. 89 (4), 587-596 (1997).
  12. Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).
  13. Jiang, S., Dong, C. A complex issue on CD4(+) T-cell subsets. Immunol Rev. 252 (1), 5-11 (2013).
  14. Rudensky, A. Y. Regulatory T cells and Foxp3. Immunol Rev. 241 (1), 260-268 (2011).
  15. Sakaguchi, S., Yamaguchi, T., Nomura, T., Ono, M. Regulatory T cells and immune tolerance. Cell. 133 (5), 775-787 (2008).
  16. Barzaghi, F., Passerini, L., Bacchetta, R. Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, x-linked syndrome: a paradigm of immunodeficiency with autoimmunity. Front Immunol. 3, 211 (2012).
  17. Shea, J. J., Paul, W. E. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4 T cells. Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).
  18. Zhou, L., Chong, M. M., Littman, D. R. Plasticity of CD4+ T cell lineage differentiation. Immunity. 30 (5), 646-655 (2009).
  19. Harrington, L. E., et al. Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages. Nat Immunol. 6 (11), 1123-1132 (2005).
  20. Langrish, C. L., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. J Exp Med. 201 (2), 233-240 (2005).
  21. Park, H., et al. A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17. Nat Immunol. 6 (11), 1133-1141 (2005).
  22. Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
  23. Chung, Y., et al. Critical regulation of early Th17 cell differentiation by interleukin-1 signaling. Immunity. 30 (4), 576-587 (2009).
  24. Reynolds, J. M., Martinez, G. J., Chung, Y., Dong, C. Toll-like receptor 4 signaling in T cells promotes autoimmune inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13064-13069 (2012).
  25. Reynolds, J. M., et al. Toll-like receptor 2 signaling in CD4(+) T lymphocytes promotes T helper 17 responses and regulates the pathogenesis of autoimmune disease. Immunity. 32 (5), 692-702 (2010).
  26. Wu, C., et al. Induction of pathogenic TH17 cells by inducible salt-sensing kinase SGK1. Nature. 496 (7446), 513-517 (2013).
  27. Ghoreschi, K., et al. Generation of pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-beta signalling. Nature. 467 (7318), 967-971 (2010).
  28. Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).
  29. Avni, O., et al. T(H) cell differentiation is accompanied by dynamic changes in histone acetylation of cytokine genes. Nat Immunol. 3 (7), 643-651 (2002).
  30. Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), (2007).
  31. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naive CD4 T lymphocytes. J Vis Exp. (79), e50765 (2013).

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Citar este artigo
Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J. Vis. Exp. (98), e52739, doi:10.3791/52739 (2015).

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