Naïve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of naïve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.
Antigen inexperienced (naïve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a naïve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during naïve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of naïve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing naïve cells to various T helper effector lineages in vitro.
Konseptet med distinkte linjer eller undergrupper av CD4 + T helper (Th) celler har eksistert siden siste del av det 20. århundre en. Anerkjennelse av beslektet antigen i nærvær av ko-stimulerende signaler resulterer i flere runder med cellulær proliferasjon og den endelige differensiering til effektor Th-celler. Typen av Th-celle generert i løpet av denne prosessen er avhengig av cytokin miljø tilstede under aktiveringen 2. I begynnelsen var naive Th-celler tenkt å polar inn to distinkte linjene følgende T-celle reseptor (TCR) aktivisering, kostimulerende CD28 ligation, og cytokin signalering. Type 1-hjelperceller (Th 1) er kjennetegnet ved deres effektor produksjon av IFNy cytokin, så vel som deres krav for IL-12 signalisering i løpet av differensieringsprosessen 3,4. Til slutt ble det oppdaget at differensierte Th1-celler har en genetisk profil som er mest karakteristiske preget by uttrykk for T boksen familie transkripsjonsfaktor, Tbx21 (T-bet), som regnes som hoved regulator av Th1 genetisk program 5. Videre kan IL-12, så vel som IFNy fremmer T-bet ekspresjon 6,7. I immunrespons, Th1-celler er viktige for verten forsvar mot intracellulære patogener samt sterke arrangører av autoimmun betennelse. I motsetning til dette, type 2-hjelperceller (Th2) krever IL-4 for deres utvikling og deres effektor cytokiner, inkludert IL-4, IL-5 og IL-13, er viktig for å drive B-celle responser og er patogene i allergi 8, 9. I likhet med Th1-celler, ble Th2-celler funnet å uttrykke sin egen herre transkripsjonell regulator, betegnes GATA-3 10,11. Interessant, tilstedeværelse av polariserende cytokiner og generering av en bestemt Th avstamning er antagonistisk til utvikling av andre, 2,12, noe som tyder på at bare en bestemt Th undergruppe kan bli dominerende under en immungjenrespons.
Etter identifikasjon av Th1 og Th2-cellelinjer, har ytterligere arbeid vist enda mer unik undergrupper av T-hjelperceller, inkludert follikulær hjelper (TFH), IL-9-produserende (Th9), og IL-22-produksjon (Th22) (nylig anmeldt i 13). Ved anvendelse av in vitro differensiering eksperimenter, vil denne protokollen fokusere ytterligere bare på to Th undergrupper, betegnet regulatoriske T-celler (treg) og IL-17-produksjon av CD4 + T-celler (Th17). CD25 + regulatoriske T-celler kan skje naturlig (nTreg) i thymus; naive Th-celler kan også fremkalles (iTreg) til å bli regulatorisk i periferien (anmeldt i 14,15). Begge typer Tregs uttrykke et karakteristisk transkripsjonsfaktor betegnet gaffelhodeboks P3 (foxp3), som er avgjørende for deres effektor undertrykkingsmekanismer som omfatter oppløselige anti-inflammatorisk mediator produksjon, IL-2-forbruk, og celle-kontakt-avhengige mekanismer 14,15. Mangelen på Foxp3 uttrykk gir en alvorlig, multi-organ autoimmun lidelse kalt immunfeilregulering, polyendocrinopathy, enteropati, X-bundet syndrom (IPEX), demonstrere kritisk rolle denne Th undergruppe i å løse betennelse og regulere perifer toleranse for selv antigener 16. In vitro, naive CD4 + T-hjelperceller oppregulerer foxp3 og bli forpliktet til treg programmet ved stimulering med IL-2 og TGF-β 14,15. Det kan være moderat til stor plastisitet i CD4 + T-celle-cellelinjer, spesielt når man vurderer bare cytokinproduksjon (oversikt i 17,18). Men i forbindelse med in vitro differensiering protokoller, vi skal diskutere hver undergruppe som en unik avstamning.
Nylig ble en undergruppe av Th17-celler som produserer IL-17 cytokin identifisert som et unikt avstamning med proinflammatoriske funksjoner som er særlig patogene under autoimmun inflammasjon 19-21. Th17 celler uttrykker en unik transkripsjonsfaktor, kalt retinoid relaterte foreldreløs reseptor gamma t (RORγt) som koordinerer Th17 genetisk program 22. TGFp er viktig for generering av Th17 avstamning gjennom induksjon av RORγt. Imidlertid er effekten av TGFp signale antas å bare indusere Th17 satsing på synergizing med IL-6 (anmeldt i 12). Videre studier har vist at en rekke andre signaler som positivt kan regulere Th17 engasjement, inkludert IL-1β, økt natrium og TLR signale 23-26. Andre rapporter har antydet at de patogene Th17-celler in vivo, er de som faktisk omgår TGFp signalering og i stedet stole på en kombinasjon av IL-1, IL-6 og IL-23 for 27 deres differensiering. Således kan Th17-celler være avledet fra en rekke forskjellige signalveier; for anvendelsen av denne protokollen, vanlig brukte (TGFp og IL-6) veien for Th17 avstamning engasjementvil bli presentert.
Differensieringen protokollen beskrevet under for alle effektor linjene er avhengig av fast antistoff som stimuli for TCR og CD28 gjennom hele løpet av eksperimentet. Men andre har vist at TCR aktivering med antigen-presenterende celler 28 eller tverrbinding anti-CD3 og anti-CD28-antistoffer med hamster-antistoff i 2 dager, 29 er også svært effektivt middel for å indusere dannelsen av forskjellige Th-undergrupper. Protokollen presenteres her bygger på tidligere rapporterte metoder for å isolere murine CD4 + T-celler fra sekundære lymfoide organer 30 og generere Th17 celler 31. En hovedforskjell er at denne protokollen er avhengig av bruk av en cellesorterer å isolere naive CD4 + T-celler fra lymfevev. Men mange bedrifter nå tilby raske separasjons kits som kan berike for naive CD4 + T-celler, som kan være i stand til å omgå kravet feller sortering, avhengig av forsøket. De fremgangsmåter og reagenser som er presentert i denne protokollen er det vi rutinemessig bruk, og finner for å være den mest effektive. Men husk at alternative reagenser og metoder finnes for mange av trinnene som presenteres nedenfor, og det er opp til den enkelte lab for å finne ut hva som fungerer best for deres formål.
Mens milten inneholder naive Th-celler, er andelen av denne populasjonen i lymfeknuter mye høyere. Unnlatelse av å identifisere og fjerne lymfeknuter i denne protokollen vil resultere i et dårlig utbytte av naive celler. Dette kan være spesielt vanskelig i eldre mus eller hannmus som har mer fettvev. Som vist i figur 1, riktig fiksering og låsing av de animalske lemmer og huden vil tillate enklere visualisering av de tilgjengelige utvendige lymfeknuter. Når lymfeknuter og milt er behandlet, er cel…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke alle medlemmer av Reynolds lab ved Rosalind Franklin medisinske og vitenskapelige universitet, og Chen Dong lab ved University of Texas MD Anderson Cancer Center for optimalisering av denne protokollen. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning til JMR fra National Institutes of Health (K22AI104941).
Complete RPMI: | Warm in a 37 oC water bath before use | ||
RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
120 micron nylon mesh | Amazon | CMN-0120-10YD | Cut into 2 cm2 squares and autoclave |
Alternative: 100 micron cell strainers | Fisher | 08-771-19 | Alternative to cutting nylon mesh |
autoMACS running buffer | Miltenyi | 130-091-221 | Warm in a 37 oC water bath before use |
autoMACS rinsing solution | Miltenyi | 130-091-222 | Warm in a 37 oC water bath before use |
CD4 beads | Miltenyi | 130-049-201 | |
ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
Cytokines: | |||
Human (h) IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
Recombinant mouse (rm) IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
rmIL-6 | R & D Systems | 406-ML-025 | |
rmIL-12 | Peprotech | 210-12 | |
hTGFb | R & D Systems | 240-B-010 | |
Antibodies: | |||
2C11 (anti-CD3) | BioXcell | BE0001-1 | |
37.51 (anti-CD28) | BioXcell | BE0015-1 | |
11B11 (anti-IL-4) | BioXcell | BE0045 | |
XMG1.2 (anti-IFNg) | BioXcell | BE0055 | |
anti-CD62L-FITC | BioLegend | 104406 | Use at 1:100 |
anti-CD25-PE | BioLegend | 102008 | Use at 1:400 |
anti-CD4-PerCP | BioLegend | 100434 | Use at 1:1000 |
anti-CD44-APC | BioLegend | 103012 | Use at 1:500 |
Phorbol 12-myristate 13 acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P-8139 | Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
Ionomycin | Sigma-Aldrich | I-0634 | Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
Brefeldin A | eBioscience | 00-4506-51 | Use at 1:1000 |