마우스 나이브 CD4<sup> +</sup> T 세포의 분리 및<em> 시험관</em> T 세포 하위 집합으로 차별화
Summary
Naïve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of naïve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.
Abstract
Antigen inexperienced (naïve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a naïve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during naïve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of naïve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing naïve cells to various T helper effector lineages in vitro.
Introduction
별개의 계통 또는 CD4 + T 도우미의 부분 집합의 개념 (목) 세포는 20 세기 한 후반 이후 주변왔다. 세포 증식 및 세포 목 이펙터로 최종 분화의 여러 라운드에서 공동 자극 신호 결과의 존재 동족 항원의 인식. 이 과정에서 생성되는 토륨 셀의 유형이 활성화 중에 본 사이토킨 환경에 의존한다. 우선, 토륨 나이브 T 세포는 세포 수용체 (TCR) 활성화, 보조 자극 CD28 결찰 및 사이토 카인이 다음과 같은 별개의 신호 계통에 편광 생각되었다. 1 형 헬퍼 세포 (TH1)는 사이토킨 IFNγ 그들의 이펙터 생산뿐만 아니라 분화 과정 중에 3,4- IL-12 시그널링 그들의 요건을 특징으로한다. 결국 차별화 된 Th1 세포가 가장 특유 B를 특징으로하는 유전 적 프로파일이 발견되었다Y TH1 유전 적 프로그램 (5)의 마스터 조절기 간주되는 T 상자 가족의 전사 인자의 발현, Tbx21 (T-내기). 또한, IL-12뿐만 아니라 IFNγ로는 T-내기 식 6, 7을 홍보 할 수 있습니다. 면역 응답하여, Th1 세포는 세포 내 병원체뿐만 아니라자가 면역 염증 강한 프로모터 대 숙주 방어에 중요하다. 대조적으로, 2 형 헬퍼 세포 (은 Th2)은 그 개발 IL-4 및 IL-4, IL-5 포함한 효과기 사이토킨, 및 IL-13을 요구, B 세포 반응을 구동하기위한 중요하고 알레르기 8 병원성, 9. Th1 세포와 마찬가지로,은 Th2 세포가 자신의 마스터의 전사 조절을 표현하는 것으로하고, GATA-3 10,11 불린다. 흥미롭게도, 편광 사이토 카인의 존재 및 특정 목 혈통의 생성은 특정 토륨 서브셋 동안 재 면역 우성 될 수 있음을 시사 2,12 등의 개발 반목sponse.
TH1 Th2에 계통의 식별 이후, 추가 작업은 최근 모낭 도우미 (TFH), (TH9) IL-9-생산 및 IL-22 생산 (Th22) (포함 T 헬퍼 세포의 더욱 부분 집합을 보여 주었다 ) 13에서 검토. 체외 분화 실험의 목적을 위해,이 프로토콜은 조절 T 세포 (TREG) 및 IL-17을 생산하는 CD4 + T 세포 (Th17)를 지칭 단에 두 개의 추가 서브 세트들을 토륨 초점을 맞출 것이다. CD25 + T 조절 세포는 흉선에서 자연적 (nTreg)가 발생할 수있다; 순진 목 세포는 (14, 15에서 검토) 주변의 규제가 될 (iTreg)을 유도 할 수있다. Tregs 두 가지 유형의 특성 전사 인자가, 용해성 항염 매개체 생산, IL-2 소모 및 셀 접촉 의존적 메커니즘 (14,15)을 포함하는 그들의 이펙터 억제 메카니즘에 중요 forkhead 상자 P3 (Foxp3를)를라고 표현한다. Foxp의 부족심각한, 다기관자가 면역 질환에서 3 식 결과는 면역 조절 장애, polyendocrinopathy, 장 질환이라, 염증을 해결하고 자기에 주변 내성을 조절하는이 목 부분 집합의 중요한 역할을 보여주는 X-연결 증후군 (IPEX)는 16 항원. 시험 관내에서, 순진한 CD4 + T 헬퍼 세포는 Foxp3의를 상향 조절하고 IL-2와 14, 15을 TGF-β가 함께 자극에 TREG 프로그램에 최선을 다하고된다. (17, 18에서 검토) 만 사이토 카인 생성을 고려할 때, 특히 CD4 + T 세포 계통 상당한 가소성 중등도가있을 수있다. 그러나, 체외 분화 프로토콜의 목적을 위해, 우리는 고유 혈통 각 서브셋을 논의한다.
최근, IL-17 사이토 카인을 생산 Th17 세포의 서브 세트는자가 면역 염증 19-21 중 특히 병원성 염증성 기능 고유 혈통로 확인되었다. Th17 세포 고유의 전사 인자를 발현, 유전자 Th17 프로그램 (22)을 좌표로 불리는 관련 레티노이드 고아 수용체 감마 t (RORγt). TGFβ는 RORγt의 유도를 통해 Th17 계보의 생성에 중요합니다. 그러나, TGFβ 신호의 효과는 (12에서 검토) IL-6와 Th17 synergizing에 약속을 유도하는 것으로 여겨진다. 또한 연구는 다른 긍정적 인 IL-1β를 포함, Th17 약속을 조절할 수있는 신호 증가 나트륨 및 TLR의 다양한 23 ~ 26 신호 것으로 나타났습니다. 다른보고는 생체 내에서 병원성 Th17 세포가 실제로 TGFβ 신호 우회 것들 대신 분화 27 IL-1, IL-6, IL-23의 조합에 의존한다고 제안했다. 따라서, Th17 세포 신호 전달 경로의 다양한로부터 유도 될 수있다; Th17 계통에 대한 약속이 프로토콜의 목적을 위해, 일반적으로 사용되는 (TGFβ 및 IL-6) 통로표시됩니다.
모든 이펙터 계통에 대한 설명 분화 프로토콜은 실험의 전 과정에 걸쳐 TCR와 CD28에 대한 자극으로 고정 된 항체에 의존한다. 그러나, 다른 보여준 그 항원 제시 세포가 28 또는 가교 항 CD3 및 햄스터 항체와 항 CD28 항체 이일 29은 다양한 토륨 서브 세트의 생성을 유도하는 매우 효과적인 수단과 TCR 활성화. 여기에 제시된 프로토콜은 Th17 세포 31 차 림프 기관 (30)로부터 쥐의 CD4 + T 세포를 분리하고 생성 이전에보고 된 방법에 작성합니다. 하나의 주요 차이점은이 프로토콜은 림프 조직으로부터 나이브 CD4 + T 세포를 분리하는 셀 소터의 사용에 의존한다는 것이다. 그러나 많은 기업들이 이제 요구 사항 F를 우회 할 수있다, 순진한 CD4 + T 세포에 대한 풍요롭게 빠른 분리 키트를 제공또는 정렬 실험에 따라. 방법과이 프로토콜에서 제시 시약은 우리가 일상적으로 사용하고 가장 효과가 무엇을 발견한다. 그러나, 대체 시약 및 방법은 아래에 제시된 많은 단계를 위해 존재한다는 것을 명심하고 자신의 목적을 위해 최선을 작동합니다 어떤 결정하기 위해 개별 실험실에 달려있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
비장은 순진한 목 세포를 포함하는 동안, 림프절이 인구의 비율이 훨씬 높다. 제대로이 프로토콜에 림프절을 식별하고 제거하지 않으면 순진한 세포의 수율이 열악 발생합니다. 이것은 더 많은 지방 조직이 나이가 마우스 또는 수컷 마우스에서 특히 어려울 수 있습니다. 동물의 사지와 피부의 그림 1, 적절한 고정 및 피닝 (pinning)에 나타낸 바와 같이 접근 외부 림프절 쉽게 시각화 수 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는이 프로토콜의 최적화를 위해 텍사스 MD 앤더슨 암 센터의 대학에서 의학 및 과학의 로잘린 프랭클린 대학의 레이놀즈 랩의 모든 구성원, 그리고 첸 동 연구소에 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 국립 보건원 (K22AI104941)에서 JMR에 부여에 의해 지원되었다.
Materials
| Complete RPMI: | Warm in a 37 oC water bath before use | ||
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 120 micron nylon mesh | Amazon | CMN-0120-10YD | Cut into 2 cm2 squares and autoclave |
| Alternative: 100 micron cell strainers | Fisher | 08-771-19 | Alternative to cutting nylon mesh |
| autoMACS running buffer | Miltenyi | 130-091-221 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| autoMACS rinsing solution | Miltenyi | 130-091-222 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| CD4 beads | Miltenyi | 130-049-201 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Cytokines: | |||
| Human (h) IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant mouse (rm) IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| rmIL-6 | R & D Systems | 406-ML-025 | |
| rmIL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| hTGFb | R & D Systems | 240-B-010 | |
| Antibodies: | |||
| 2C11 (anti-CD3) | BioXcell | BE0001-1 | |
| 37.51 (anti-CD28) | BioXcell | BE0015-1 | |
| 11B11 (anti-IL-4) | BioXcell | BE0045 | |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | BioXcell | BE0055 | |
| anti-CD62L-FITC | BioLegend | 104406 | Use at 1:100 |
| anti-CD25-PE | BioLegend | 102008 | Use at 1:400 |
| anti-CD4-PerCP | BioLegend | 100434 | Use at 1:1000 |
| anti-CD44-APC | BioLegend | 103012 | Use at 1:500 |
| Phorbol 12-myristate 13 acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P-8139 | Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I-0634 | Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Brefeldin A | eBioscience | 00-4506-51 | Use at 1:1000 |
Referências
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