Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.
Invasie van omringende normale weefsels wordt algemeen beschouwd als een essentieel kenmerk van kwaadaardig (in tegenstelling tot goedaardige) tumoren. Voor bepaalde kankers in het bijzonder (bijvoorbeeld hersentumoren zoals glioblastoom multiforme en plaveiselcelcarcinoom van het hoofd en de nek -. SCCHN) is een oorzaak van ernstige morbiditeit en kan levensbedreigend zelfs bij afwezigheid van metastasen op afstand zijn. Bovendien kankers die een recidief na behandeling nog vaak aanwezig met een agressiever fenotype. Daarom is er een mogelijkheid om het proces van invasie richten op nieuwe therapieën die complementair zijn aan standaard anti-proliferatieve middelen zouden kunnen zijn. Tot nu toe is deze strategie werd gehinderd door het ontbreken van een robuuste, reproduceerbare assays die geschikt zijn voor een gedetailleerde analyse van de invasie en voor drug discovery. Hier bieden we een eenvoudige micro-plaat methode (op basis van uniforme, zelfassemblerende 3D bolvormige tumoren), die een groot potentieel voor een dergelijke stu heeftoverlijdt. We illustreren de assay platform met een humane glioblastoma cellijn en ook SCCHN model waarbij de ontwikkeling van resistentie tegen gerichte epidermale groeifactor receptor (EGFR) remmers gepaard met verhoogde matrix-invasief potentieel. We bieden ook twee alternatieve methoden van semi-automatische kwantificatie: de ene met een imaging cytometer en een tweede die gewoon nodig standaard microscopie en beeld vast te leggen met een digitale beeldanalyse.
Klassieke ontwikkeling antikankergeneesmiddel is grotendeels gericht op het gebruik van in vitro op cellen gebaseerde assays voor het screenen op cytotoxische middelen die proliferatie van tumorcellen remmen en / of bevorderen geprogrammeerde celdood (apoptose). Recenter zijn pogingen bewogen naar gerichte therapieën bij de ontwikkeling van remmers van de onderliggende moleculaire oorzaak van kwaadaardige celproliferatie. Ondanks de spectaculaire resultaten zijn dergelijke middelen vaak geassocieerd met de snelle ontwikkeling van resistentie. Aangezien het invasieve en metastatische vermogen van tumorcellen die verantwoordelijk is voor de meerderheid van sterfgevallen door kanker, en recidief ziekte presenteert vaak agressiever fenotype, is het logisch ook complementair in vitro experimentele modellen 1,2 tot nieuwe identificatie te overwegen middelen die deze extra key 'kenmerken' van kanker zal remmen.
Tijdens kwaadaardige progressie, tumorcellen verwervende mogelijkheid om het omringende weefsel binnen te dringen en / of verspreid in afgelegen organen (metastase). Kankercellen doordringen in de basaal membraan door de vorming van invadopodia 3,4. Deze structuren zijn verrijkt met actine filamenten specifieke adhesie-eiwitten en proteasen en gezamenlijk verantwoordelijk voor tumor celbeweeglijkheid en afbraak van de extracellulaire matrix (ECM) 5. Invadopodia uit te breiden naar de ECM en worden verondersteld belangrijk voor tumorcel invasie te zijn en ook de extravasatie in vasculaire kanalen, hematogene (of lymfatische) verspreiding en metastase te vergemakkelijken.
Voor standaardmethoden tumorcel invasie in vitro omvatten het volgende te evalueren. Transwell-gebaseerde of Boyden-kamer assays 2,6 waarin enkelvoudige celsuspensies worden geënt op een filter bekleed met een dikke laag ECM-afgeleide eiwitten. Cellen dringen en vervolgens verplaatsen naar de onderste kamer in reactie op een chemo-attractant. Veel gebruikte ECMeiwitten zijn type I collageen, of basaal membraan-achtige matrix (BMM bijvoorbeeld Matrigel, afgeleid van de EHS tumor 7) de natuurlijke samenstelling van basismembranen nabootst.
Als alternatief voor de filter gebaseerde Type Boyden kamer 8 assays, kunnen cellen worden geënt bovenop een ECM gel (waarnaar fibroblasten kunnen worden toegevoegd) wanneer zij een monolaag en vormen dan individueel of collectief dringen in de gel. Invasion kan worden gemeten in termen van het aantal binnenvallende cellen en / of de afgelegde afstand van het gel oppervlak 9. Tumorcellen kunnen ook volledig worden ingebed in een matrix hetzij als celsuspensie of sferoïden – meestal geplaatst tussen twee lagen van ECM gel- waardoor cellen binnendringen van de tumormassa in de omgevende matrix 2,6,10,11.
De driedimensionale (3D) tumor sferoïde invasie assay hier beschreven is, een snelle, automatiseerbare invasie systeem door een highly reproduceerbare gestandaardiseerde werkwijze 12 in een 96-well plaat formaat met een sferoïde per putje. BMM wordt direct toegevoegd aan elk putje van een halfvaste matrix waarin tumorcellen binnendringen van het bolvormige lichaam. De omvang van tumorcel invasie gecontroleerd met tussenpozen gedurende 72-96 uur. Deze werkwijze heeft de volgende voordelen ten opzichte van huidige in vitro invasie bovenstaande assays: de tumorcellen zijn georganiseerd in een 3D-structuur nabootsen van een tumor micro-omgeving of een micro-metastase; de bolvormige tumoren zijn zeer reproduceerbaar in grootte; de invasie assay wordt uitgevoerd in situ in dezelfde plaat als tumor sferoïde ontwikkeling zonder de noodzaak om deze secundaire platen bewegen; de werkwijze, gecombineerd met de nieuwste technologie van geautomatiseerde beeldanalyse, zodat zowel hoog gehalte en high throughput analyse van tumorcel invasie.
De beeldanalyse wordt uitgevoerd met een beeldvormend cytometer, die een 96-well scansplaat binnen 10 min. Via de samenvloeiing toepassing de mate en snelheid van de invasie bereikt door enkele cellen of celgroepen uitspreiden van de bolvormige tumoren en invasie in de matrix kan worden gemeten in een dynamische wijze. Voor lagere throughput wordt een alternatieve methode voor het gepresenteerde analyse, gebaseerd op het gebruik van een omgekeerde microscoop en standaard beeldverwerkingssoftware.
De beide tumormodellen beschreven (glioblastoma en SCCHN) werden specifiek geselecteerd om onze assay 3D illustreren zoals ze klinisch relevant lokaal invasieve kankers met een onvervulde behoefte aan effectieve therapieën 12. Na behandeling met geneesmiddelen, evaluatie van in vitro farmacodynamische (PD) biomarker veranderingen kunnen eenvoudig worden uitgevoerd door Western blot of immunoassays van lysaten na het gebruik van specifieke in de handel verkrijgbare reagentia naar cel herstel van BMM en / of immunofluorescente analyse van invasie bolvormige tumoren in hele toestaan mount vlekken.
Dit invasie assay is een nuttige techniek voor snelle en reproduceerbare beoordeling van tumorcel invasie in een halfvast medium en daarom bijzonder geschikt voor latere in vitro screenen van geneesmiddelen. Kankercellen binnenvallen matrix in een 3D manier als ze verspreid een "micro-tumor", vertegenwoordigd door de tumor sferoïde, en strekken zich in een extracellular matrix-achtige omgeving. De ware driedimensionaliteit van de assay is zichtbaar in de celmorfologie, die verschilt van de vlakke, hechtende cellen morfologie aannemen tijdens het verplaatsen op een vast substraat. De mate van invasie gemakkelijk gekwantificeerd met behulp van een beeldvormende cytometer, waardoor een automatische uitlezing, of met een gewone microscoop in combinatie met beeldverwerkingssoftware. Bovendien is deze methode geschikt voor het fluorescent imaging 13 (bijvoorbeeld bij cellijnen die fluorescerende eiwitten of vooraf gemerkt met fluorescente kleurstoffen).
De werkwijze is eenvoudig uit te voeren met het enige kritische stap voorgesteld door de toevoeging van de BMM, wanneer er een risico van verstoring van de middenstand van de sferoïde in de put U-vormig. Dit kan leiden tot suboptimale beeldanalyse met bolletjes in verschillende beeldvlakken. Het is derhalve kritisch voor de BMM voorzichtig en langzaam goed aan elke. Na BMM Daarnaast is het raadzaam om de plaat te controlerenonder een microscoop en als de lokalisatie onacceptabel wordt beschouwd, kan dit worden verholpen door zacht centrifugeren. Met ervaring is dit zelden nodig. Hoewel deze werkwijze is robuust en zeer reproduceerbaar, kunnen inter-experimentele variatie optreden met verschillende batches van BMM. Om dit te vermijden, is het raadzaam om voldoende BMM kopen van een enkele partij aan een reeks studies voltooien.
Een beperking van de werkwijze (zoals voor dergelijke assays) is het moeilijk om onderscheid te maken tussen invasie en proliferatie, waarbij de tumorcellen waarschijnlijke ondergaan gedurende de test periode. Hoewel de verdubbelingstijd van de cellen in aanmerking kan worden genomen of celcyclus remmers zoals cytochalasine D ingevoerd, is het niet gemakkelijk te controleren of een duidelijk onderscheid tussen deze twee aspecten van tumorprogressie, in het bijzonder voor snel groeiende tumorcellen en voor die die een meer "uitgebreide" dan infiltratieve, invasie patroon. Om deze redenwordt voorgesteld dat een parallelle 3D growth assay wordt uitgevoerd om specifieke effecten van remmende of stimulerende middelen te evalueren. Bij zorgvuldige dosis respons studies worden uitgevoerd, kan het mogelijk zijn om concentraties die gevolgen proliferatie minimaliseren selecteren. Zo hebben we aangetoond dat het HSP90 remmer 17-AAG remt U-87 MG 3D tumor sferoïde invasie al op 24 uur en bij concentraties beneden de concentratie die 3D-groei met 50% (GI 50) 12.
Anderzijds, de betekenis van deze assay in vergelijking met andere standaard invasie assays (bijv filter gebaseerde bepalingen of invasie van enkele cellen in 3D-matrices 1), dat tumorcellen binnendringen in het omgevende matrix in het sferoïde, dat lijkt op een " micro-tumor "of" micro-metastase ", waardoor rekening gehouden met belangrijke aspecten van de pathofysiologie van een tumormassa. De methode die we presenteren geeft informatie over decollectief gedrag van tumorcellen, bij eerste verlaten van de sferoïden, alsmede afzonderlijk, als enkele cellen bereiken meer afgelegen gebieden van de BMM. Bovendien kunnen cellen in bolvormige tumoren hypoxie en voedingsstoffen ontbering ervaren die door veranderingen in genexpressie, kan bevorderen migratie en invasie; dergelijke functies ontbreken in 2D assays. Bovendien, dit alles in een high-throughput-formaat door het gebruik van specifieke 96-putjesplaten en de nieuwste beeldvormingstechnologie, waardoor een complexe 3D assay gemakkelijk gebruik in targetvalidatie en drug discovery.
De werkwijze die we voorstellen is geschikt voor verdere verzoeken om aanvullende aspecten van tumorcel invasie pakken. In het bijzonder kunnen extra complexiteit door toevoeging van gastheercellen, zoals fibroblasten en / of endotheelcellen worden overwogen, in het bolvormige zelf of de omringende matrix. Dit kan ook worden gemodificeerd, niet alleen wat betreft de stijfheid (door het gebruik van verschillende concentrations van BMM), maar ook qua samenstelling (door toevoeging van andere componenten afhankelijk van de specifiek weefsel / orgaan van de vastgestelde tumormodel: bijvoorbeeld tenascine voor hersenkanker 16 en collageen voor borstcarcinoom 17).
Een vergelijkbare opstelling (vorming van sferoïden en imaging) kunnen ook worden aangepast om weefsel invasie beoordelen 3D, waarbij bolvormige tumoren worden samen gekweekt met embryoid organen lijkt op een complex weefsel 12 of andere celspecifieke organoids (bijvoorbeeld astrocyten voor glioma 18 of crypte culturen voor gastro-intestinale kankers), maar verder werk is nodig om automatische beeldanalyse in te schakelen.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by The National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (G1000121 ID no.94513) and the Oracle Cancer Trust. SE is supported by The Institute of Cancer Research and Cancer Research UK (grant number C309/A8274). We acknowledge NHS funding to the NIHR Biomedical Research Centre.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Web address |
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | http://www.corning.com Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips |
Cultrex Basement Membrane Extract, PathClear | Trevigen | 3432-005-01 | http://www.trevigen.com Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips |
Ultra-low attachment 96-well plate | Corning | 7007 | http://www.corning.com |
EGF | Miltenyi Biotec | 130-093-825 | http://www.miltenyibiotec.com Add 100 µl 1% BSA (w/v) in water to 100 µg EGF. To 25 µl of this, add 4,975 µl RHB-A medium to give a 10 µg/ml working stock. Aliquot and store at -20ºC |
RHB-A medium | Stem Cells Inc. | SCS-SF-NB-01 | http://www.stemcellsinc.com For diluting EGF |
DMEM | GIBCO | 31966-021 | http://www.lifetechnologies.com/ Warm in 37 °C waterbath before use |
Fetal Bovine Serum | Biosera | 1001/500 | http://www.biosera.com Heat at 56 °C to inactivate complement before use |
TrypLE | GIBCO | 12605 | http://www.lifetechnologies.com/ Cell dissociation solution |
Celigo cytometer | Nexcelom Bioscience | n/a | http://www.nexcelom.com Specialist equipment for image capture and analysis. Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative |
IX70 inverted microscope | Olympus | n/a | http://www.olympus.co.uk/ Used with camera for manual image capture |
Retiga Exi Fast 1394 digital camera | Qimaging | n/a | http://www.qimaging.com/ Attached to microscope for manual image capture |
Image-Pro Plus 7.0 | Media Cybernetics | n/a | http://www.mediacy.com/ Software used to control camera and microscope for manual image capture |
Image-Pro Analyzer 7.0 | Media Cybernetics | n/a | http://www.mediacy.com/ Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size |
Excel 2010 | Microsoft | n/a | http://www.microsoft.com/ Scientific graphing and statistical software |
Prism 6.0 | GraphPad | n/a | http://www.graphpad.com/ Scientific graphing and statistical software |