We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.
L'électrorétinogramme (ERG) est une méthode non invasive électrophysiologique pour déterminer la fonction rétinienne. Grâce à la mise en place d'une électrode sur la surface de la cornée, l'activité électrique généré en réponse à la lumière peut être mesurée et utilisée pour évaluer l'activité des cellules rétiniennes in vivo. Ce manuscrit décrit l'utilisation de l'ERG pour mesurer la fonction visuelle chez le poisson zèbre. Poisson zèbre ont longtemps été utilisé comme un modèle pour le développement des vertébrés raison de la facilité de la suppression de gènes par des oligonucléotides morpholino et la manipulation pharmacologique. A 5-10 dpf, seuls les cônes sont fonctionnelles dans la rétine des larves. Par conséquent, le poisson zèbre, la différence d'autres animaux, est un puissant système modèle pour l'étude de la fonction visuelle cône in vivo. Ce protocole utilise l'anesthésie standard, micromanipulation et protocoles stéréomicroscopie qui sont communs dans les laboratoires qui effectuent des recherches de poisson zèbre. Les méthodes décrites font usage de l'équation d'électrophysiologie normeATION et une caméra basse lumière pour guider le placement du micro-électrodes d'enregistrement sur la cornée larvaire. Enfin, nous démontrons comment un ERG stimulateur / enregistreur disponible dans le commerce à l'origine conçu pour une utilisation avec des souris peut facilement être adapté pour une utilisation avec le poisson zèbre. ERG de poisson zèbre larves fournit une excellente méthode de dosage cône fonction visuelle chez les animaux qui ont été modifiés par injection d'oligonucléotides morpholino ainsi que des techniques d'ingénierie des génomes plus récents tels que Zinc Finger nucléases (ZFN), Transcription Activator-Like effecteur nucléases (TALENs), et cluster régulièrement espacées courtes répétitions palindromiques (CRISPR) / Cas9, qui ont tous fortement augmenté l'efficacité et l'efficacité du ciblage de gène chez le poisson zèbre. En outre, nous profitons de la capacité des agents pharmacologiques pour pénétrer larves de poisson zèbre pour évaluer les composants moléculaires qui contribuent à la photoréponse. Ce protocole décrit une configuration qui peut être modifié et utilisé par les chercheursavec différents objectifs expérimentaux.
L'électrorétinogramme (ERG) est une méthode électrophysiologique non invasive qui a été largement utilisé en clinique pour déterminer la fonction de la rétine chez les humains. L'activité électrique en réponse à un stimulus lumineux est mesuré en plaçant des électrodes d'enregistrement sur la surface externe de la cornée. Les caractéristiques du modèle de stimulus et la forme d'onde de réponse définissent les neurones rétiniens qui contribuent à la réponse. Cette méthode a été adaptée pour une utilisation avec un certain nombre de modèles animaux, y compris les souris et le poisson zèbre. La réponse ERG vertébrés typique a quatre composantes principales: l'une d'onde, qui est un potentiel de cornée négatif provenant de l'activité des cellules photoréceptrices; la b-ondes, un potentiel de cornée positif dérivé de l'ON cellules bipolaires; le d-ondes, un potentiel de cornée positif interprété comme l'activité des cellules bipolaires OFF; et c-ondes, qui se produit quelques secondes après le b-ondes et reflète l'activité dans la glie Müller et retInal épithélium pigmentaire 1-4. Références supplémentaires pour comprendre l'histoire et les principes de l'analyse ERG chez les humains et les animaux modèles sont le manuel en ligne, WebVision, de l'Université de l'Utah et des textes tels que les Principes et pratique de électrophysiologie clinique de Vision 4, 5.
Danio rerio (poisson zèbre) a longtemps été privilégiée comme un modèle pour le développement des vertébrés, en raison de sa maturation et la transparence rapide, ce qui permet pour l'analyse morphologique non invasive de systèmes d'organes, les tests comportementaux et les deux avant et arrière écrans génétiques (pour revue, voir Fadool et Dowling 6). Larves de poisson zèbre sont prêtent très bien à la manipulation génétique et pharmacologique, qui, lorsqu'il est couplé avec leur taux de fécondité élevé, en font un modèle animal excellente pour les analyses biologiques à haut débit. Le ratio plus élevé de cônes à des tiges chez le poisson zèbre larves – environ 1: 1 par rapport à des souris (~ 3% cônes) – rendent particulièrement utile pour l'étude de la fonction de cône 7-9.
Dans la rétine de vertébrés, cônes se développent avant 10 tiges. Fait intéressant, les cônes de poisson zèbre sont opérationnels dès 4 dpf, permettant une analyse électrophysiologique sélective des cônes à ce stade 6, 11,12. En revanche, les réponses ERG en tiges apparaissent entre 11 et 21 dpf 13. Par conséquent, larves de poisson zèbre à 4-7 servir dpf fonctionnellement comme une rétine tout-cône. Cependant, la réponse ERG photopique natif de 4-7 larves de DPF est dominée par la b-ondes. Application des agents pharmacologiques, tels que la L – (+) – 2-amino-4-phosphono-butyrique (L-AP4), un agoniste de glutamate métabotropique (mGluR6) récepteur exprimé par les cellules conductrices bipolaires, bloque efficacement la génération de la b-ondes et révèle le potentiel de masse isolée de cône du récepteur, (la «une vague») 14-17.
Nous décrivons ici un simple et reliablméthode de e pour l'analyse ERG en utilisant l'équipement disponible dans le commerce ERG conçu pour une utilisation avec des souris qui ont été conçus pour être utilisés avec des larves de poisson zèbre. Ce système peut être utilisé sur des larves de poisson zèbre divers milieux génétiques, ainsi que ceux traités avec des agents pharmacologiques, pour aider les chercheurs à l'identification des voies qui contribuent à la sensibilité visuelle et adaptation à la lumière 16 signalisation. Les procédures expérimentales décrites dans ce protocole guideront les enquêteurs dans l'utilisation de l'analyse ERG pour répondre à une variété de questions biologiques relatives à la vision, et de démontrer la construction d'une configuration souple ERG.
Dans ce protocole, une procédure simple pour les enregistrements ERG de poisson zèbre larvaire est détaillé. Cette procédure permet une analyse rapide et complète de Visual function.There sont plusieurs étapes critiques tout au long de la procédure qui doit être gardé à l'esprit. Les larves de poisson zèbre doit être en bonne santé avant l'expérience pour éviter la mort au cours des traitements potentiels de la drogue et de se assurer des moyens de subsistance prolongée pendant les enregistremen…
The authors have nothing to disclose.
We thank members of the UNC Zebrafish Aquaculture facility for maintenance of the zebrafish. We would also like to thank Diagnosys, LLC for assistance with the setup of the ERG apparatus. Additional thanks go to Dr. Portia McCoy and the laboratory of Dr. Ben Philpot for assistance with electrophysiological methods. We also wish to thank Lizzy Griffiths for her illustration of a larval zebrafish. This work was supported by National Institutes of Health awards F32 EY022279 (to J.D.C) and R21 EY019758 (to E.R.W).
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description (optional) |
Faraday cage | 80/20 Inc | custom | Custom designed aluminum "Industrial Erector Set" for Cage framework |
PVA sponge | Amazon | B000ZOWG1C | Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae |
150 ml Sterile Filter systems | Corning | 431154 | Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes |
Espion E2 | Diagnosys, LLC | contact | Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com |
Colordome | Diagnosys, LLC | contact | Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com |
Micromanipulator | Drummond | 3-000-024-R | Holding and positioning the recording microelectrode |
Magnetic ring stand | Drummond | 3-000-025-MB | Holding and positioning of the camera and refrence electrode |
Lead extensions | Grass Technologies | F-LX | Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes |
Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor | Grass Technologies | DF-215/10 | Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins |
Window screen frame (metal) and spline | Lowes or Home Depot | various | For attaching copper mesh to Faraday cage framework |
Steriflip 50 ml filters | Millipore | SCGP00525 | Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes |
BNC adaptor | Monoprice | 4127 | Connecting camera to BNC cable |
BNC cable | Monoprice | 626 | Connecting camera to video adaptor |
Camera lens | Navitar | 1582232 | Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea |
Camera coupler | Navitar | 1501149 | Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea |
Luna BNC to VGA + HDMI Converter | Sewell | SW-29297-PRO | BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor |
APB | Sigma | A1910 | mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential |
Borosilicate glass | Sutter | BF-150-86-10 | Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821°C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter) |
P97 Flaming/Brown puller | Sutter | P97 | For pulling glass micropipettes |
Sorbothane sheet | Thorlabs | SB12A | Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size |
Breadboard | Thorlabs | B2436F | Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen |
Passive Isolation Mounts | Thorlabs | PWA074 | Provides vibration isolation to breadboard |
Copper mesh | TWP | 022X022C0150W36T | To line Faraday Cage |
Pipette pump | VWR | 53502-233 | Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae |
Pasteur pipettes | VWR | 14672-608 | Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae |
Camera | Watec | WAT-902B | Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea |
Tricaine (MS-222) | Western Chemical | Tricaine-S | Pharmaceutical-grade anesthetic, |
Micro-fil | WPI | MF28G-5 | Filling microelectrode holder and microelectrode glass |
Microelectrode holder | WPI | MEH2SW15 | Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment |
Reference Electrode | WPI | DRIREF-5SH | Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode |
Reference Electrode (alternative) | WPI | EP1 | Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead |
Low-noise cable for Microelectrode holder | WPI | 13620 | Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard |