Elektroretinogramm Analyse der Sicht Antwort in Zebrafisch-Larven
Summary
We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.
Abstract
Das Elektroretinogramm (ERG) ist eine nicht-invasive elektrophysiologische Verfahren zur Bestimmung der Netzhautfunktion. Durch die Anordnung einer Elektrode auf der Oberfläche der Hornhaut, in Antwort auf Licht erzeugte elektrische Aktivität kann gemessen und verwendet, um die Aktivität von Netzhautzellen in vivo zu beurteilen. Diese Handschrift beschreibt die Verwendung von der ERG zur Sehfunktion im Zebrafisch zu messen. Zebrafische sind seit langem als Modell für die Entwicklung von Wirbeltieren wegen der Leichtigkeit der Gen-Unterdrückung durch Morpholino Oligonukleotiden und pharmakologische Manipulation genutzt. 5-10 dpf sind nur Zapfen Funktions im Larvennetzhaut. Daher ist die Zebrafisch, im Gegensatz zu anderen Tieren, ist ein leistungsfähiges Modellsystem für das Studium der Kegel visuellen Funktion in vivo. Dieses Protokoll verwendet Standard-Anästhesie, Mikromanipulation und Stereomikroskopie-Protokolle, die in Labors, die Zebrafisch-Forschung führen gemeinsam sind. Die beschriebenen Methoden verwenden Standard-Elektrophysiologie equipment und eine Lichtkamera, um die Platzierung der Aufnahme Mikroelektroden auf die Larvenhornhaut führen. Schließlich zeigen wir, wie ein handelsüblicher ERG Stimulator / Recorder ursprünglich für den Einsatz mit Mäusen entwickelt, kann leicht für die Verwendung mit Zebrafisch angepasst werden. ERG der Larven Zebrafisch ist eine ausgezeichnete Verfahren zur Untersuchung Kegel Sehfunktion bei Tieren, die von Morpholino Oligonukleotid Einspritzung geändert wurden, sowie neuere Genom-Engineering-Techniken wie beispielsweise Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs) Transkriptionsaktivator-Like Effektor Nukleasen (Talens) und Regelmäßig gruppierten beabstandeten Kurz Palindromic Repeats (CRISPR) / Cas9, alle haben die Effizienz und Wirksamkeit des Gen-Targeting in Zebrabärbling stark erhöht. Darüber hinaus nutzen wir die Fähigkeit von pharmakologischen Mitteln zur Zebrafisch-Larven, die molekularen Komponenten, die dem Photo beitragen bewerten zu durchdringen. Dieses Protokoll beschreibt eine Einrichtung, die geändert und von den Forschern verwendet werden könnenmit verschiedenen experimentellen Ziele.
Introduction
Das Elektroretinogramm (ERG) ist eine nicht-invasive elektrophysiologischen Verfahren, die ausführlich in der Klinik für die Bestimmung der Funktion der Retina in Menschen verwendet wird. Die elektrische Aktivität in Reaktion auf einen Lichtreiz, wird durch Anordnen Aufzeichnungselektroden auf der äußeren Oberfläche der Hornhaut gemessen. Die Eigenschaften des Reizparadigma und der Antwort-Wellenform zu definieren, die retinalen Neuronen, die zur Reaktion. Dieses Verfahren ist für den Einsatz mit einer Reihe von Tiermodellen, einschließlich Mäusen und Zebrafisch angepasst. Die typische Wirbel ERG Antwort hat vier Hauptkomponenten: das a-Welle, die eine Hornhaut-negatives Potential von Photorezeptorzellaktivität abgeleitet ist; die b-Welle, eine Hornhaut-positives Potential von der ON bipolaren Zellen abgeleitet; der d-Welle, eine Hornhaut-positiven Potential wie die Aktivität der OFF bipolaren Zellen interpretiert; und die c-Welle, die nach der b-Welle einige Sekunden auftritt und spiegelt Aktivität in Müller Glia und retinal Pigmentepithel 1-4. Zusätzliche Hinweise für das Verständnis der Geschichte und Prinzipien der ERG Analyse bei Menschen und Modelltiere sind die Online-Lehrbuch, Webvision, von der University of Utah und Texte wie den Principles and Practice of Clinical Elektrophysiologie des Sehens 4, 5.
Danio rerio (Zebrafisch) ist seit langem als Modell für die Entwicklung von Wirbeltieren begünstigt worden, aufgrund seiner schnellen Reifung und Transparenz, die für die nichtinvasive morphologische Analyse von Organsystemen, Verhaltens-Assays und sowohl vorwärts und rückwärts genetischen Screens (zur Übersicht siehe Fadool und ermöglicht Dowling 6). Zebrafisch-Larven sind sehr gut für genetische und pharmakologische Manipulation, die, wenn sie mit ihrer hohen Fruchtbarkeit, machen sie eine ausgezeichnete Tiermodell für die Hochdurchsatz-biologischen Analysen. Das höhere Verhältnis von Kegeln mit Stangen in Larven Zebrabärbling – etwa 1: 1 im Vergleich zu Mäusen (~ 3% Konuse) – machen sie besonders nützlich für die Untersuchung der Kegelfunktion 7-9.
In der Retina von Wirbeltieren entwickeln Kegel vor Stangen 10. Interessanterweise sind Zebrafisch Kegel operative bereits 4 dpf, was eine selektive elektrophysiologische Analyse der Kegel in diesem Stadium 6, 11,12. Im Gegensatz dazu ERG-Antworten in Stäbe erscheinen zwischen 11 und 21 dpf 13. Daher Zebrafisch-Larven bei 4-7 dpf funktionell dienen als All-Kegel Netzhaut. Allerdings ist die Mutterphotopischen ERG Antwort von 4-7 dpf Larven von der b-Welle dominiert. Anwendung von pharmakologischen Mitteln, wie beispielsweise L – (+) – 2-Amino-4-phosphono-buttersäure (L-AP4), ein Agonist des metabotropen Glutamat (mGluR6) Rezeptors durch den, bezogen auf die bipolaren Zellen, blockiert wirksam die Erzeugung der b-Welle und zeigt die isolierte Kegel Masse receptor potential, (die "a-Welle"), 14-17.
Hier beschreiben wir eine einfache und reliable Verfahren für ERG Analyse mit handelsüblichen ERG Geräte für den Einsatz mit Mäusen, die für die Verwendung mit Zebrafisch-Larven adaptiert wurden konzipiert. Dieses System kann auf Zebrafisch-Larven mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen, sowie diejenigen, mit pharmakologischen Mitteln behandelt, die Forscher bei der Identifizierung von Signalwegen, die visuelle Empfindlichkeit und leichte Anpassung 16 beitragen unterstützen genutzt werden. Die in diesem Protokoll beschriebenen experimentellen Verfahren wird Ermittler im Gebrauch von ERG-Analyse, um eine Vielzahl von biologischen Fragen zu beantworten Vision führen und zeigen den Aufbau eines flexiblen ERG-Setup.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll ein einfaches Verfahren für die ERG-Aufnahmen von Larven Zebrafisch wird beschrieben. Dieses Verfahren ermöglicht eine schnelle und umfassende Test der visuellen function.There gibt mehrere wichtige Schritte im Rahmen des Verfahrens, das im Auge behalten werden sollte. Der Zebrafisch-Larven sollten gesund sein, bevor das Experiment zu Tode während der potenzielle medikamentöse Behandlungen zu vermeiden und eine längere Lebensunterhalt während der ERG-Aufnahmen. Darüber hinaus ist es wichtig, d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank members of the UNC Zebrafish Aquaculture facility for maintenance of the zebrafish. We would also like to thank Diagnosys, LLC for assistance with the setup of the ERG apparatus. Additional thanks go to Dr. Portia McCoy and the laboratory of Dr. Ben Philpot for assistance with electrophysiological methods. We also wish to thank Lizzy Griffiths for her illustration of a larval zebrafish. This work was supported by National Institutes of Health awards F32 EY022279 (to J.D.C) and R21 EY019758 (to E.R.W).
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description (optional) |
| Faraday cage | 80/20 Inc | custom | Custom designed aluminum "Industrial Erector Set" for Cage framework |
| PVA sponge | Amazon | B000ZOWG1C | Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae |
| 150 ml Sterile Filter systems | Corning | 431154 | Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes |
| Espion E2 | Diagnosys, LLC | contact | Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com |
| Colordome | Diagnosys, LLC | contact | Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com |
| Micromanipulator | Drummond | 3-000-024-R | Holding and positioning the recording microelectrode |
| Magnetic ring stand | Drummond | 3-000-025-MB | Holding and positioning of the camera and refrence electrode |
| Lead extensions | Grass Technologies | F-LX | Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes |
| Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor | Grass Technologies | DF-215/10 | Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins |
| Window screen frame (metal) and spline | Lowes or Home Depot | various | For attaching copper mesh to Faraday cage framework |
| Steriflip 50 ml filters | Millipore | SCGP00525 | Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes |
| BNC adaptor | Monoprice | 4127 | Connecting camera to BNC cable |
| BNC cable | Monoprice | 626 | Connecting camera to video adaptor |
| Camera lens | Navitar | 1582232 | Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea |
| Camera coupler | Navitar | 1501149 | Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea |
| Luna BNC to VGA + HDMI Converter | Sewell | SW-29297-PRO | BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor |
| APB | Sigma | A1910 | mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential |
| Borosilicate glass | Sutter | BF-150-86-10 | Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821°C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter) |
| P97 Flaming/Brown puller | Sutter | P97 | For pulling glass micropipettes |
| Sorbothane sheet | Thorlabs | SB12A | Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size |
| Breadboard | Thorlabs | B2436F | Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen |
| Passive Isolation Mounts | Thorlabs | PWA074 | Provides vibration isolation to breadboard |
| Copper mesh | TWP | 022X022C0150W36T | To line Faraday Cage |
| Pipette pump | VWR | 53502-233 | Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae |
| Pasteur pipettes | VWR | 14672-608 | Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae |
| Camera | Watec | WAT-902B | Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea |
| Tricaine (MS-222) | Western Chemical | Tricaine-S | Pharmaceutical-grade anesthetic, |
| Micro-fil | WPI | MF28G-5 | Filling microelectrode holder and microelectrode glass |
| Microelectrode holder | WPI | MEH2SW15 | Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment |
| Reference Electrode | WPI | DRIREF-5SH | Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode |
| Reference Electrode (alternative) | WPI | EP1 | Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead |
| Low-noise cable for Microelectrode holder | WPI | 13620 | Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard |
Referências
- Dowling, J. E. . The retina: an approachable part of the brain. , (1987).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. J Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).
- Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. J Neurophysiol. 91, 1134-1142 (2004).
- Heckenlively, J. R., Arden, G. B. . Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision. , (2006).
- Perlman, I., Kolb, H., Nelson, R., Fernandez, E., Jones, B. . Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).
- Fadool, J. M., Dowling, J. E. Zebrafish: a model system for the study of eye genetics. ProgRetin. Eye Res. 27, 89-110 (2008).
- Doerre, G., Malicki, J. Genetic analysis of photoreceptor cell development in the zebrafish retina. Mech. Dev. 110, 125-138 (2002).
- Brockerhoff, S. E., et al. Light stimulates a transducin-independent increase of cytoplasmic Ca2+ and suppression of current in cones from the zebrafish mutant nof. J Neurosci. 23, 470-480 (2003).
- Rinner, O., Makhankov, Y. V., Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C. Knockdown of cone-specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone response recovery and delayed dark adaptation. Neuron. 47, 231-242 (2005).
- Harada, T., Harada, C., Parada, L. F. Molecular regulation of visual system development: more than meets the eye. Genes Dev. 21, 367-378 (2007).
- Branchek, T. The development of photoreceptors in the zebrafish, brachydaniorerio. II. Function. J Comp Neurol. 224, 116-122 (1984).
- Schmitt, E. A., Dowling, J. E. Early retinal development in the zebrafish, Daniorerio: light and electron microscopic analyses. J Comp Neurol. 404, 515-536 (1999).
- Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish. Dev Dyn. 222, 564-570 (2001).
- Wong, K. Y., Adolph, A. R., Dowling, J. E. Retinal bipolar cell input mechanisms in giant danio. I. Electroretinographic analysis. J Neurophysiol. 93, 84-93 (2005).
- Nelson, R. F., Singla, N. A spectral model for signal elements isolated from zebrafish photopicelectroretinogram. Vis Neurosci. 26, 349-363 (2009).
- Korenbrot, J. I., Mehta, M., Tserentsoodol, N., Postlethwait, J. H., Rebrik, T. I. EML1 (CNG-modulin) controls light sensitivity in darkness and under continuous illumination in zebrafish retinal cone photoreceptors. J Neurosci. 33, 17763-17776 (2013).
- Gurevich, L., Slaughter, M. M. Comparison of the waveforms of the ON bipolar neuron and the b-wave of the electroretinogram. Vision Res. 33, 2431-2435 (1993).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Daniorerio). , (2007).
- Kim, D. Y., Jung, C. S. Gap junction contributions to the goldfish electroretinogram at the photopic illumination level. Korean J PhysiolPharmacol. 16, 219-224 (2012).
- Brockerhoff, S. E., Dowling, J. E., Hurley, J. B. Zebrafish retinal mutants. Vision Res. 38, 1335-1339 (1998).
- Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from colour units in the retina of fish (Cyprinidae). J Physiol. 185, 536-555 (1966).
- Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from luminosity units in the retina of fish (Cyprinidae). J Physiol. 185, 587-599 (1966).
- Shao, X. M., Feldman, J. L. Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials. J Neurosci. Methods. 159, 108-115 (2007).
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. ProcNatlAcadSci. U S A. 92, 10545-10549 (1995).
- Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish. CSH protocols. , (2008).
- Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C. Ganzfeld ERG in zebrafish larvae. Doc Ophthalmol. 104, 57-68 (2002).
- Kainz, P. M., Adolph, A. R., Wong, K. Y., Dowling, J. E. Lazy eyes zebrafish mutation affects Müller glial cells, compromising photoreceptor function and causing partial blindness. J Comp Neurol. 463, 265-280 (2003).
- Lewis, A., et al. Celsr3 is required for normal development of GABA circuits in the inner retina. PLoS. genetics. 7, e1002239 (2011).
