We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.
Elektroretinogram (ERG) är en icke-invasiv elektrofysiologisk metod för bestämning retinal funktion. Genom placering av en elektrod på ytan av hornhinnan, elektriska aktiviteten genereras som svar på ljuset kan mätas och användas för att utvärdera aktiviteten av retinala celler in vivo. Detta manuskript beskriver användningen av ERG för att mäta synfunktionen i zebrafisk. Zebrafisk har länge använts som en modell för ryggradsdjur utveckling på grund av den enkla gensuppression genom morfolinogrupper oligonukleotider och farmakologisk manipulation. Vid 5-10 dpf, bara kottar är funktionella i larv näthinnan. Därför, zebrafisk, till skillnad från andra djur, är ett kraftfullt modellsystem för studier av könen synfunktionen in vivo. Detta protokoll använder standard anestesi, mikromanipulation och stereomikroskopi protokoll som är vanliga i laboratorier som utför zebrafisk forskning. De beskrivs metoder att använda sig av standardelektrofysiologi equipment och ett svagt ljus kamera för att styra placeringen av inspelningen mikroelektrod på larvhornhinnan. Slutligen visar vi hur en kommersiellt tillgänglig ERG stimulator / inspelare ursprungligen konstruerad för användning med möss kan enkelt anpassas för användning med zebrafisk. ERG av larver zebrafisk ger en utmärkt metod för att analysera kon synfunktion hos djur som har modifierats av morfolino oligonukleotid injektion samt nyare genomingenjörstekniker såsom zinkfinger nukleaser (ZFNs), Transkription Activator-Like Effector nukleaser (Talens), och klustrade Regelbundet mellanrum Korta palindromiska Upprepar (CRISPR) / Cas9, som alla har kraftigt ökat effektiviteten och effekten av riktad genmodifiering i zebrafisk. Dessutom tar vi nytta av möjligheten för farmakologiska medel att tränga zebrafisk larver att utvärdera de molekylära komponenter som bidrar till fotoresponsen. Detta protokoll beskriver en inställning som kan ändras och används av forskaremed olika experimentella mål.
Elektroretinogram (ERG) är en icke-invasiv elektrofysiologisk metod som har använts i stor utsträckning i kliniken för att bestämma funktionen av näthinnan hos människor. Den elektriska aktiviteten som svar på en Ijusstimulus mäts genom att placera registreringselektrod på den yttre ytan av hornhinnan. Egenskaperna för stimulans paradigm och svarsvågformen definierar näthinnans nervceller bidrar till svaret. Denna metod har anpassats för användning med ett antal djurmodeller inklusive möss och zebrafisk. Den typiska ryggradsdjur ERG svar har fyra huvudkomponenter: a-våg, som är en hornhinna-negativ potential härrör från fotoreceptor cellaktivitet; b-våg, en hornhinna-positiv potential härledd från PÅ bipolära celler; d-våg, en hornhinna-positiv potential tolkas som aktiviteten hos de OFF bipolära celler; och c-våg, som uppträder flera sekunder efter det att B-vågen och återspeglar aktiviteten i Muller Glia och retginalets pigmentepitel 1-4. Ytterligare referenser för att förstå historien och principer för ERG analys hos människor och modelldjur är online lärobok, Webvision, från University of Utah och texter såsom Principles and Practice of Clinical Elektro av Vision 4, 5.
Danio rerio (zebrafisk) har länge använts som en modell för ryggradsdjur utveckling, på grund av dess snabba mognad och öppenhet, vilket möjliggör icke-invasiv morfologisk analys av organsystem, beteendeanalyser och både framåt och bakåt genetiska skärmar (för översikt se Fadool och Dowling 6). Zebrafisk larver är mycket mottagliga för genetisk och farmakologisk manipulation, vilket, när den kombineras med deras höga fruktsamhet, gör dem till en utmärkt djurmodell för hög genomströmning biologiska analyser. Den högre förhållande mellan koner till stavar i larvzebrafisk – ungefär 1: 1 jämfört med möss (~ 3% kons) – gör dem särskilt användbara för studier av konen funktion 7-9.
I ryggradsdjur näthinnan, koner utvecklas innan stängerna 10. Intressant, zebrafisk kottar är operativ så tidigt som 4 dpf, vilket möjliggör selektiv elektrofysiologiska analys av koner i det skedet 6, 11,12. Däremot ERG svar i stavar visas mellan 11 och 21 dpf 13. Därför zebrafisk larver vid 4-7 dpf fungera funktionellt som en all-kon näthinnan. Emellertid är den nativa fotopiska ERG svaret hos 4-7 dpf larver domineras av b-vågen. Tillämpning av farmakologiska medel, såsom L – (+) – 2-amino-4-fosfono-smörsyra (L-AP4), en agonist för metabotropa glutamat (mGluR6) receptorn uttryckt av PÅ bipolära celler, effektivt blockerar alstringen av b-vågen och avslöjar den isolerade kon massreceptorpotential, ("a-wave") 14-17.
Här beskriver vi en enkel och reliable metod för ERG analys med hjälp av kommersiellt tillgängliga ERG utrustning avsedd för användning med möss som har anpassats för användning med zebrafisk larver. Detta system kan utnyttjas på zebrafisk larver av olika genetiska bakgrunder, liksom de som behandlats med farmakologiska medel, för att hjälpa forskarna vid identifiering av signalvägar som bidrar till visuell känslighet och ljus anpassning 16. De experimentella förfaranden som beskrivs i detta protokoll kommer att vägleda utredarna i användningen av ERG analys för att svara på en rad olika biologiska frågor som rör synen, och demonstrera byggandet av en flexibel ERG setup.
I detta protokoll en enkel procedur för ERG inspelningar av larver zebrafisk beskrivs. Detta förfarande möjliggör en snabb och omfattande analys av visuell function.There finns flera viktiga steg under hela förfarandet som bör hållas i åtanke. Den zebrafisk larver bör vara friska före försöket att förhindra dödsfall under potentiella läkemedelsbehandlingar och se långvarig försörjning under ERG inspelningar. Dessutom är det viktigt att larverna utnyttjas i experiment är tätt åldersmatchade. Detta b…
The authors have nothing to disclose.
We thank members of the UNC Zebrafish Aquaculture facility for maintenance of the zebrafish. We would also like to thank Diagnosys, LLC for assistance with the setup of the ERG apparatus. Additional thanks go to Dr. Portia McCoy and the laboratory of Dr. Ben Philpot for assistance with electrophysiological methods. We also wish to thank Lizzy Griffiths for her illustration of a larval zebrafish. This work was supported by National Institutes of Health awards F32 EY022279 (to J.D.C) and R21 EY019758 (to E.R.W).
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description (optional) |
Faraday cage | 80/20 Inc | custom | Custom designed aluminum "Industrial Erector Set" for Cage framework |
PVA sponge | Amazon | B000ZOWG1C | Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae |
150 ml Sterile Filter systems | Corning | 431154 | Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes |
Espion E2 | Diagnosys, LLC | contact | Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com |
Colordome | Diagnosys, LLC | contact | Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com |
Micromanipulator | Drummond | 3-000-024-R | Holding and positioning the recording microelectrode |
Magnetic ring stand | Drummond | 3-000-025-MB | Holding and positioning of the camera and refrence electrode |
Lead extensions | Grass Technologies | F-LX | Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes |
Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor | Grass Technologies | DF-215/10 | Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins |
Window screen frame (metal) and spline | Lowes or Home Depot | various | For attaching copper mesh to Faraday cage framework |
Steriflip 50 ml filters | Millipore | SCGP00525 | Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes |
BNC adaptor | Monoprice | 4127 | Connecting camera to BNC cable |
BNC cable | Monoprice | 626 | Connecting camera to video adaptor |
Camera lens | Navitar | 1582232 | Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea |
Camera coupler | Navitar | 1501149 | Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea |
Luna BNC to VGA + HDMI Converter | Sewell | SW-29297-PRO | BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor |
APB | Sigma | A1910 | mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential |
Borosilicate glass | Sutter | BF-150-86-10 | Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821°C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter) |
P97 Flaming/Brown puller | Sutter | P97 | For pulling glass micropipettes |
Sorbothane sheet | Thorlabs | SB12A | Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size |
Breadboard | Thorlabs | B2436F | Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen |
Passive Isolation Mounts | Thorlabs | PWA074 | Provides vibration isolation to breadboard |
Copper mesh | TWP | 022X022C0150W36T | To line Faraday Cage |
Pipette pump | VWR | 53502-233 | Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae |
Pasteur pipettes | VWR | 14672-608 | Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae |
Camera | Watec | WAT-902B | Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea |
Tricaine (MS-222) | Western Chemical | Tricaine-S | Pharmaceutical-grade anesthetic, |
Micro-fil | WPI | MF28G-5 | Filling microelectrode holder and microelectrode glass |
Microelectrode holder | WPI | MEH2SW15 | Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment |
Reference Electrode | WPI | DRIREF-5SH | Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode |
Reference Electrode (alternative) | WPI | EP1 | Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead |
Low-noise cable for Microelectrode holder | WPI | 13620 | Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard |